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    降解丙烯酰胺菌的筛选及应用开题报告.doc

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    降解丙烯酰胺菌的筛选及应用开题报告.doc

    江西师范大学本科生毕业设计(论文)开题报告 学号 学生姓名 学院 生命科学学院 专业 生物工程 选题编号 届别 2011届 指导教师 姓名及职称 教 授 中文题目 降解丙烯酰胺菌的筛选及应用 外文题目 Screening of acrylamide degradation bacteria and its application 开 题 报 告 内 容 一、本研究的立论依据和目标 1. 本项目研究意义及同类研究工作在国内外研究现状与存在的问题 1.1研究意义 丙烯酰胺Acrylamide,简称AM是一种无气味的白色晶体,在工业上主要用于合成聚丙烯酰胺PAM。PAM由于具有特殊的物理化学性质,因而广泛应用于石油开采、污水处理、造纸、矿产、医药、农业、纺织等行业,享有“百业助剂”之称。丙烯酰胺具有神经毒性,可损伤周围神经系统和中枢神经系统,常人每天允许的最大暴露量不超过0.0005mg/kg。化工医药行业的废水中常含有丙烯酰胺,对环境造成污染,危害人类健康。利用微生物的生命活动对废水中的污染物进行处理是目前最重要,最有发展前途,也是最常用的废水处理方法。丙烯酰胺既是化学试剂也是一种重要的工业原料,可以用它来聚合一种新型有机高分子絮凝剂,用于可产生较少污泥的污水处理中,但在丙烯酰胺的共聚物产品中,由于反应率不是100,有少量的丙烯酰胺的单体(原料)残存在产品中,在制造应用丙烯酰胺聚合体的工业中,都会排出含有丙烯酰胺单体的废水,丙烯酰胺单体难于分解,且具有毒性,为避免环境污染,就需要寻找去除丙烯酰胺单体的方法。目前,降解有机污染物的处理技术中,应用具有特殊分解能力的微生物的投菌法具有广阔的前景。本研究就是从从自然界中分离筛选降解丙烯酰胺的微生物菌种,并达到了试验预期的目标。 。 开 题 报 告 内 容 1.2 降解丙烯酰胺菌的研究现状与存在的问题 1.2.1 国内外研究现状及发展方向 食品中丙烯酰胺的危险性评估 丙烯酰胺(CH2CH-CONH2)是一种白色晶体物质,分子量为70.08,是1950年以来广泛用于生产化工产品聚丙烯酰胺的前体物质。聚丙烯酰胺主要用于水的净化处理、纸浆的加工及管道的内涂层等。在欧盟,丙烯酰胺年产量约为8-10万吨。 2002年4月瑞典国家食品管理局(National Food Administration,NFA)和斯德哥尔摩大学研究人员率先报道,在一些油炸和烧烤的淀粉类食品,如炸薯条、炸土豆片、谷物、面包等中检出丙烯酰胺;之后挪威、英国、瑞士和美国等国家也相继报道了类似结果。由于丙烯酰胺具有潜在的神经毒性、遗传毒性和致癌性,因此食品中丙烯酰胺的污染引起了国际社会和各国政府的高度关注。为此,2002年6月25日世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)联合紧急召开了食品中丙烯酰胺污染专家咨询会议,对食品中丙烯酰胺的食用安全性进行了探讨。2005年2月,联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)联合食品添加剂专家委员会(JECFA)第64次会议根据近两年来的新资料,对食品中的丙烯酰胺进行了系统的危险性评估。 对丙烯酰胺的危险性评估重点为致癌效应的评估。由于流行病学资料及动物和人的生物学标记物数据均不足以进行评价,因此根据动物致癌性试验结果,用8种数学模型对其致癌作用进行分析。最保守的估计,推算引起动物乳腺瘤的BMDL为0.3 mg/kg /天,根据人类平均摄入量为1.0mg/kg /天,高消费者为4.0 mg/kg /天计算,平均摄入和高摄入量人群的 MOE分别为300和75。JECFA认为对于一个具有遗传毒性致癌物来说,其MOE值较低,也就是诱发动物的致癌剂量与人的可能最大摄入量之间的差距不够大,比较接近,其对人类健康的潜在危害应给予关注,建议采取合理的措施来降低食品中丙烯酰胺的含量。目前,欧洲有些食品生产企业在减少食品加工过程中丙烯酰胺的产生方面已取得了很好的效果。 开 题 报 告 内 容 1.2.2存在的关键问题及解决方案的提出 丙烯酰胺毒性 急性毒性急性毒性试验结果表明,大鼠、小鼠、豚鼠和兔的丙烯酰胺经口LD50为150-180 mg/kg,属中等毒性物质。 神经毒性和生殖发育毒性大量的动物试验研究表明丙烯酰胺主要引起神经毒性;此外,为生殖、发育毒性。神经毒性作用主要为周围神经退行性变化和脑中涉及学习、记忆和其他认知功能部位的退行性变;生殖毒性作用表现为雄性大鼠精子数目和活力下降及形态改变和生育能力下降。大鼠90天喂养试验,以神经系统形态改变为终点,最大未观察到有害作用的剂量(NOAEL)为0.2 mg/kg bw/天。大鼠生殖和发育毒性试验的NOAEL为2 mg/kg bw/天。 遗传毒性丙烯酰胺在体内和体外试验均表现有致突变作用,可引起哺乳动物体细胞和生殖细胞的基因突变和染色体异常,如微核形成、姐妹染色单体交换、多倍体、非整倍体和其他有丝分裂异常等,显性致死试验阳性。并证明丙烯酰胺的代谢产物环氧丙酰胺是其主要致突变活性物质。 致癌性动物试验研究发现,丙烯酰胺可致大鼠多种器官肿瘤,包括乳腺、甲状腺、睾丸、肾上腺、中枢神经、口腔、子宫、脑下垂体等。国际癌症研究机构(IARC) 1994年对其致癌性进行了评价,将丙烯酰胺列为2类致癌物(2A)即人类可能致癌物,其主要依据为丙烯酰胺在动物和人体均可代谢转化为其致癌活性代谢产物环氧丙酰胺。由于煎炸食品是我国居民主要的食物,为减少丙烯酰胺对健康的危害,我国应加强膳食中丙烯酰胺的监测与控制,开展我国人群丙烯酰胺的暴露评估,并研究减少加工食品中丙烯酰胺形成的可能方法。对于广大消费者,专家建议 1、尽量避免过度烹饪食品(如温度过高或加热时间太长),但应保证做熟,以确保杀灭食品中的微生物,避免导致食源性疾病。 2提倡平衡膳食,减少油炸和高脂肪食品的摄入,多吃水果和蔬菜。 3、建议食品生产加工企业,改进食品加工工艺和条件,研究减少食品中丙烯酰胺的可能途径,探讨优化我国工业生产、家庭食品制作中食品配料、加工烹饪条件,探索降低乃至可能消除食品中丙烯酰胺的方法。 开 题 报 告 内 容 二、本课题研究内容、研究目标和拟解决的关键问题 2.1研究内容 (1) 微生物菌种的筛选 水样接入富集培养基,30℃摇床培养2天,将富集培养基中的培养液1ml接入30ml选择性液体培养基中,30℃100r摇床培养3天,取培养液进行梯度稀释后平板划线培养,根据菌落形态挑选出现频率较高的菌株1、2。 (2) 微生物菌种的分离、纯化【4】 将菌株1、2在选择性液体培养基中培养,分别取培养液进行梯度稀释,制成10-2,l0-4,lO-6,10-8,10-10五个梯度,每个梯度取0.1ml涂布在2个重复的选择性固体培养基平板,于30℃培养3天,分离、纯化出1、2的单菌落,转至斜面试管上编号保存。 (3) 菌株降解丙烯酰胺的测定方法【5】 为了确定丙烯酰胺的吸收波长,配制了不同浓度丙烯酰胺溶液,在UNICO UV-2100紫外分光光度计上进行扫描,确定丙烯酰胺的吸收波长为260nm,以下实验中均采用260nm的波长。 (4)菌株生理生化性质测定【6,7】 由于实验参照简明第八版伯杰细菌鉴定手册、常见细菌系统鉴定手册对筛选的细菌进行生理生化性质测定,将细菌初步鉴定到属。鉴定方法主要有革兰氏染色法、芽孢染色法、荚膜染色、接触酶试验、甲基红试验、V-P实验、明胶液化、葡萄糖氧化发酵实验。 (5)菌株生源及生长条件优化【8,9】 丙烯酰胺是具有毒性的有机物,需向培养液中添加营养元素以促进微生物生长从而使丙烯酰胺降解。实验确定了外加碳源、氮源、磷源及其最佳浓度,优化了菌株在纯培养条件下降解丙烯酰胺的最佳生长条件。 1、降解时间的影响 2、接种量的影响将最优菌株向培养基中分别按不同的体积分数接种。在已优化的条件下培养2天后测定丙烯酰胺的降解率 3、培养温度的影响分别设定了不同的生长温度,在同等条件下培养。测定不同温度下最优菌株对1000 mgL-1AM溶液的降解效果。对丙烯酰胺溶液的降解率进行了测定,从而确定了降解实验的最佳温度 4、初始pH值的影响 5、氧含量的影响在摇瓶试验中,含氧量的直接控制和测定都比较困难,通常利用改变摇床转速的方式调节含氧量,提高转速是提高液体培养基氧含量的重要手段。 2.2 研究目标 1 通过现代化的基因工程技术,获得具有降解丙烯酰胺的基因工程菌。 2 结合现代生物发酵工艺,通过调节pH及不同的温度,不同的诱导物的浓度及其诱导时间,溶氧(OD值)等相关的影响发酵的参数,提高基因工程菌表达能力。 开 题 报 告 内 容 2.3 拟解决的关键问题 1提取含有目的基因菌株的活性污水,样品采自江西省昌九农科化工有限公司厌氧池活性污泥处理废水。 2对菌种进行分离,并筛选出具有降解丙烯酰胺能力的菌株,挑选出最优菌种。 3 实验参照简明第八版伯杰细菌鉴定手册、常见细菌系统鉴定手册对筛选的细菌进行生理生化性质测定,将细菌初步鉴定到属。鉴定方法主要有革兰氏染色法、接触酶试验、甲基红试验、V-P实验、葡萄糖氧化发酵实验 4对可以降解丙烯酰胺的菌株进行优化处理,运用到培养基培养中。 丙烯酰胺含量的测定 为了确定丙烯酰胺的吸收波长,配制不同浓度的丙烯酰胺标准溶液,在UNICO UV-2100紫外分光光度计上进行扫描,最终确定丙烯酰胺的吸收波长为260nm,以下研究实验中均采用260nm的波长测定丙烯酰胺的含量[10]。 丙烯酰胺标准溶液准确称取0.5g 丙烯酰胺(含量99.9%),溶解在去离子水中,定量转移入100ml 容量瓶中,并稀释至刻度。此溶液为5mg/ml 标准贮备液。 丙烯酰胺标准曲线在12只具塞试管中,分别加入0.00、0.05、0.10、0.30、0.50、0.70、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8和2.0ml 标准溶液,各加水至5.00ml,配成0.00、0.05、0.10、0.30、0.50、0.70、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8和2.0mg/ml 标准系列。在紫外分光光度计上260nm处测定不同浓度的丙烯酰胺溶液随吸光度变化的标准曲线。 三. 本项目的创新之处及立论根据 3.1 本项目的创新之处 (1)该方法技术含量高,而且目的性极强,可靠性好. (2)构建成功的丙烯酰胺菌代谢周期短,代谢背景清楚,易实现高密度的培养,能够大大的提高丙烯酰胺的生产量,进而筛选出降解性能好的优势菌株。 3、2 立论根据 (1)本课题是现代基因工程技术与实际应用紧密结合的良好体现之一.从而实现产,学,研的紧密结合,为现在工业生产服务. (2)现代基因工程技术已经被广泛被生物特技工作者所应用,且在很多方面显示出了无可比拟的优势. (3)世界各国科技工作者的对现代基因工程技术的成功应用,大大增强了我们获得成功的信念,且国内外生物科技工作者已做过相关的基础研究工作. 开 题 报 告 内 容 四. 研究工作的预期结果或成果 筛选出能降解污水中丙烯酰胺的菌种,并通过改变温度、接种量、PH值、降解时间等条件的变化,对该菌进行生长条件优化,筛选出优势菌种,并在实验室进行培养基培养。 五.研究工作的总体安排及进度 2010.11~2010.12 取原水样品并提取出丙烯酰胺 2010.12~2011.01 从污水中筛选出能降解丙烯酰胺的菌种并进行生理生化性质测定。 2011.2~2011.03 提取最优菌种并进行生长条件优化 2011.03~2010.04完成课题的全部工作,整理资料,撰写论文. 参考文献 [1] 陈跖, 孙旭东, 史悦, 等. 微生物法生产丙烯酰胺的研究 Ⅰ 腈水合酶产生菌株的培养和高活力的表达. 生物工程学报,2002 ,171 55~58 [2] 沈寅初,张凡国,韩建生. 微生物法生产丙烯酰胺. 工业微生物,1994,2424~32 [3] Wang M,Lu G,Ji G,et al . Enantioselective biotransations of acemic α-2substituted phenylacetonitriles and phenylacetamides using Rhodococcus sp. AJ270. Tetrahedron Asymmetry ,2000 ,11 1123~1135 [4] Takeharu T ,Toshiaki F ,Hiromi M,et al . Molecular cloning of two R 2species enoyl2CoA hydratase genes from Pseudomonasaeruginosa and their use for polyhydroxyalkanoate synthesis. FEMS Microbiol Letters ,1999 ,184 193~198 [5] Nojiri M,Yohda M,Odaka M,et al . Functional expression of nitrile hydratase in Escherichia coli Requirement of a nitrile hydratase activator and post2translational modification of a ligand cysteine. J Biochem,1999 ,125 4 696~704 [6] Gilligan T , Yamada H , Nagasawa T. Production of S2 222 phenylpropionic acid from R , S222phenylpropionitrile by the ombination of nitrile hydratase and stereoselective amidase inRhodococcus equi TG328. Appl Microbiol Biotechnol , 1993 , 39 720~725 [7] Asano Y, Yamada H. A New Enzyme Nitrile Hydratase which Degrades Acetonitrile in Combination with Amidase [J ] . Agric.Biol. Chem. ,1980 ,44 2251. [8] 罗九甫,李孝士,李亚红. 产腈水合酶的恶臭假单胞菌的固定化[J ] . 工业微生物,1998 ,19 4 13 - 17. 开 题 报 告 内 容 [9] Wu S ,Fallon R ,Payne M. Over2production of stereoselective nitrile hydratase from Pseudomonas putida 5B in Escherichia coli activity requires a novel downstream protein. Appl Microbiol Biotechnol ,1997 ,48 6 704~708 [10] Trott S ,Burger S ,Calaminus C. Cloning and heterologous expression of an enantio selective amidase from Rhodococcus erythropolis strain MP50. Appl Environ Microb ,2002 ,68 7 3279~3286 [11] Endo I , Odaka M. What evidences were elucidated about photoreactive nitrile hydratase. J Mol Cat B Enzymatic , 2000 , 101 81~86 [12] Duran R. New shuttle vectors for Rhodococcus sp. R312 erly Brevibacterium sp. R312 , a nitrile hydratase producing strain. J Basic Microbiol ,1998 ,38 2 101~106 [13] Piersma S ,Nojiri M,Tsujimura M,et al . Arginine 56 mutation in the beta subunit of nitrile hydratase importance of hydrogen bonding to the non2heme iron center. J Inorg Biochem, 2000 , 80 3-4 283~288 开 题 报 告 内 容 学生签名 年 月 日 指导教师签名 年 月 日

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