• / 4
  • 下载费用:10 金币  

基因型鉴定 中科院版.doc

关 键 词:
基因型鉴定 中科院版.doc
资源描述:
1. 鼠尾 DNA 提取第一天:1. 剪取小鼠尾尖(同样适用于脚趾,胚胎组织,卵黄膜等,若不立即提取,可以放置 4℃数日)放入 1.5ml EP 管。2. 每管加入鼠尾裂解液 350ul +10ul 蛋白酶 K(简称 PK,10mg/ml,现用现加)。3. 55℃水浴消化过夜第二天:4. 用劲将消化好的组织摇匀(可用振荡器摇匀)。5. 每管加入 350ul 酚/氯仿(苯酚:氯仿:异戊醇 25:24:1,事先配好,4 ℃保存)。6. 上下充分混匀,室温静置 3 分钟后,离心,12000 转,30 分钟。7. 取出离心后的 EP 管,可见液体分为三层,取上层无色水相液体约 200μl 于新1.5ml EP 管中,注意勿吸取中层液体。(不能将中间的蛋白层吸起来,否则会对后续的实验造成影响。为防止压力过大,可使用切去尖端的枪头)。8. 向新 EP 管中加入 400μl 无水乙醇(为 2 倍于上清的体积),上下颠倒混匀,此时应可看到白色丝状样的 DNA。9. 离心 12000 转,10 分钟。10. 可看到有白色沉淀,弃去上清,加入 1ml 的 75%乙醇,将沉淀弹起,以便去除DNA 上过多的离子。11. 离心,12000 转,10 分钟。12. 弃去上清,倒置 EP 管于吸水纸上,室温干燥约 15 分钟(注意不能过分干燥,以免基因组 DNA 难溶解)。 13. 加入 150-200μl (根据 DNA 沉淀的量)无菌蒸馏水或者是 TE Buffer,可放置 37℃助溶。14. 短期 4℃,长期-20 ℃保存。相关配方:1. 鼠尾裂解液配方1000ml 溶解液中含:100mM Tris-HCl pH8.55mM EDTA0.2%SDS200mM NaCl室温保存。2. 蛋白酶 K 溶液:取 100mg 蛋白酶 K,加去离子水 10ml 使成 10mg/ml,分装后冻存于-20℃,用时溶 解。3. 酚/氯仿:取 Tris 平衡酚 50ml,氯仿 48ml,异戊醇 2ml 加入 100ml 棕色试剂瓶中 混匀,4℃避光保存。2. 基因鉴定 PCR 反应标准的 PCR 反应体系: 10×扩增缓冲液 10ul4 种 dNTP 混合物 各 200umol/L引物 各 10~100pmol 模板 DNA 0.1~2ug Taq DNA 聚合酶 2.5U Mg 2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至 100ul以我们实验室常用的 PCR25ul 体系为例:10xbuffer: 2.5uldNTP 2ulMgCl2: 1.5ulPrimer F: 1ulPrimer R: 1ulTaq 酶: 0.5ulDNA 模板: 1~3ul去离子水加至: 25ul退火温度根据引物合成说明书决定PCR 操作注意事项:1) PCR 的复合管配制需在冰上进行,尤其 taq 酶需始终放于冰上,或者在最后加入时从-20° 冰箱拿出,加完后立即放回。2) PCR 反应极为灵敏,操作过程应当注意避免样本之间的相互污染,吸取不同样本时应当换枪头。3. 琼脂糖凝胶电泳1. 根据欲分离 DNA 片断大小用凝胶缓冲液(TAE 缓冲液)配制适宜浓度的琼脂糖凝胶,以 1%胶为例:称取琼脂糖 1 克,倒入通风橱内的锥形瓶中,尽量不要让粉末沾在内壁上。用量筒量取 1×TAE100ml ,倒入锥形瓶,戴入一次性手套混匀。2. 戴一次性手套把锥形瓶放入微波炉,加热 3min 左右,使琼脂糖彻底溶解,看不到颗粒为止。在此期间插好制胶的板槽和梳子。3. 迅速将锥形瓶置于通风橱内,冷却片刻,用通风橱内 20μl 枪,吸 6~10ul(0.05%)的EB,插入液面,轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液,倒入电泳槽中,注意避免产生气泡,如有气泡,应设法除去。(枪头应丢入指定垃圾箱)4. 等待 30min 冷却。5. 凝固后,戴一次性手套,先两端起开一点梳子,再将梳子完全拔出,将胶安放在电泳槽内。6. 向电泳槽中倒入电泳缓冲液,其量以没过胶面 1mm 为宜,如样品孔内有气泡,应设法除去。退掉一次性手套加样。7. 每个 25ul 样本加入 6×buffer 5ul,混匀后,将样品缓冲液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内。8. 加样后。带上一次性手套接通电源,插上+/ -极,切记 DNA 样品由负极往正极泳动。设置电压,一般为 60-100V,按下 RUN 开始电泳,电泳 15-30 分钟即可。9. 根据指示剂泳动的位置,判断是否终止电泳;一般前端染料到 2/3 处即可。10. 电泳完毕后,戴一次性手套关掉电泳仪。拿出胶版,推出胶。在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置,并与核酸分子
展开阅读全文
  微传网所有资源均是用户自行上传分享,仅供网友学习交流,未经上传用户书面授权,请勿作他用。
0条评论

还可以输入200字符

暂无评论,赶快抢占沙发吧。

关于本文
本文标题:基因型鉴定 中科院版.doc
链接地址:https://www.weizhuannet.com/p-10031989.html
微传网是一个办公文档、学习资料下载的在线文档分享平台!

微传网博客

网站资源均来自网络,如有侵权,请联系客服删除!

 网站客服QQ:80879498  会员QQ群:727456886

copyright@ 2018-2028 微传网络工作室版权所有

     经营许可证编号:冀ICP备18006529号-1 ,公安局备案号:13028102000124

收起
展开