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左旋多巴(L-多巴)简介.doc

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生物酶催化生产 L-多巴简介1、L-多巴简介左旋多巴(3,4-dihydroxyphenyl-L-ananine,简称 L-DOPA)的化学名称为 3,4-二羟基苯基丙氨酸,其结构式为:作为一种重要的生物活性物质,L-DOPA 是从 L-酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生化代谢途径过程中的重要中间产物。L-DOPA 的衍生物—多巴胺是一种重要的神经递质,由于多巴胺不能透过血脑屏障进入脑组织,所以不能通过补充多巴胺来治疗帕金森氏病,而 L-DOPA 可以通过血脑屏障,并在脑组织中脱羧形成多巴胺,从而使脑组织中多巴胺含量增加而达到治疗的目的。Birkmayer 于 1961 年用左旋多巴治疗 PD 获得明显疗效。由罗氏公司开发,其制剂美多巴于 1973 年 7 月在瑞士首次上市。迄今为止,仍是治疗帕金森病最有效的药物之一。L-DOPA 还可用来治疗弱视;利用酪氨酸酶将 L-酪氨酸转化,经 L-DOPA 形成黑色素,可用于毛发染色;此外,人们还发现 L-DOPA 有抗衰老的功效。 2、L-多巴的合成方法1911 年,Casimir Funk 在实验室中第一次成功合成 D,L-DOPA。1913 年,Marcus Guggenheim 从蚕豆豆荚中第一次分离提取到天然存在于植物体内的 L-DOPA。目前,L-DOPA 主要通过从植物中提取、化学法合成以及微生物酶法转化等方法生产获得。虽然猫豆等植物中存在的多巴都是左旋的,提取过程中免去了与手性异构体 D-DOPA 的拆分工艺,并且 L-DOPA 的提取得率也相应得到了一些提高,但由于受到原料来源少、产量小的限制,因而生产成本较高,从植物中提取 L-DOPA 难以大规模生产,远不能满足市场需求。上世纪 70 年代初,国外化学法合成 L-DOPA 的年产量已达 150吨,但由化学法所合成出来的产物是 D-型和 L-型的混合物,而 D-DOPA 会引起人体毒性反应,因此应用于医学临床之前必须通过控制旋光度的方法来减少 D-DOPA 的影响。解决此问题的最好办法是使 D-型和 L-型多巴完全分开,但 D-型和 L-型多巴的拆分非常困难。与从植物中提取及化学合成相比,微生物酶法生物合成 L-DOPA,具有生产周期短、可连续大批量生产等优点。2005 年世界 L-DOPA 年产量为 250 吨左右,其中大部分是通过微生物酶法生物合成的。3、本项目技术介绍酪氨酸酚裂解酶,又名 β-酪氨酸酶,以 PLP 为辅酶,TPL 可以催化 L-酪氨酸发生 β-消去反应生成苯酚、丙酮酸和氨。由于这个反应是可逆的,将邻苯二酚代替苯酚后,可由邻苯二酚、丙酮酸和氨可在 TPL 催化下生成 L-DOPA。本项目技术将编码 TPL 的基因片段转入大肠杆菌中进行高密度发酵表达,从而获得大量酪氨酸酚裂解酶。以邻苯二酚、丙酮酸和氨为底物,经 TPL 催化反应生成 L-多巴。目前本项目技术指标发酵 24h 左右湿菌重 100g/L 左右,生物转化反应 20h 左右,产物浓度 50g/L 左右。工程菌的构建和发酵、转化工艺均还在优化中,技术指标仍有提升空间。4、成本估算指标:转化反应投菌量为 6%,产物浓度 50g/L,转化率 90%,纯化收率 80%。发酵菌体湿重(粗酶)为 120kg/t 左右。1t 发酵液成本(包括原料、人工及能耗)为 2400 元左右。表 1 1T 转化反应液成本估算试剂 单价(元/Kg) 用量(Kg) 总价(元)邻苯二酚 27.5 31.02 853.05丙酮酸 50 24.81 1240.5硫酸铵 1.0 37.23 37.23湿菌体 20 60 1200合计 3330.78L-多巴 40如上表,最后得到 40kg 产品,成本约为 83.27 元/kg(包括发酵全部成本、转化反应原料成本) ,其余包括分离纯化成本及能耗、人工等成本也按 83.27 元/kg 计算,即 L-多巴的生产成本估算为 166.54元/kg。
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