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实验一 培养基母液的制备.ppt

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实验一 培养基母液的制备,本学期计划,,教学效果评价方案,,,平时成绩,实验报告,期末成绩,,,,出勤 课堂表现:听课情况、课堂操作,预习报告:10%条理性、书写规范 实验报告:10%条理性、书写规范实验结果正确性,可信性、思考题回答正确性,操作考试:20%抽签 笔试:30%,20%,30%,50%,,一、实验室设计与要求 在进行组织培养工作之前,首先应对工作中需要那些基本的设备条件有全面的了解。 实验室设计最基本应该有三个室: 准备室无菌操作室 培养室,,,,(一)、准备室 完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、配制、培养基分装及高压灭菌;器皿、材料的洗涤等工作。 1、水槽:洗涤用 2、高压灭菌锅:培养基、工具的灭菌 3、干燥箱:器皿等烘干用 4、冰箱:存放培养基母液、酶、 激素等用 5、酸度计(pH计、酸度测定计): 培养基酸度测定用,6、天平: 制作培养基用 粗天平(1/1000):称量大量元素、蔗糖、琼脂等 精密天平( 1/10000、 1/100000 ):称量微量元素、激素等 7、玻璃器皿:三角瓶、试管、培养罐、培养皿、烧杯、量筒、 移液管等 8、移液枪(根据条件需要)由枪和枪头组成 9、其他:工作台、微波炉、电炉等,,,,缓冲间(过渡室),(二)、无菌操作室 无菌操作室并非无菌,但应该保持清洁 1、超净工作台:内设紫外灯、吹风装置 每次实验前要用紫外灯灭菌20分钟以上,然后喷酒精灭菌,工作过程中注意一直开着吹风机,并且一定要关掉紫外灯,过滤网应经常清洗。 2、无菌操作用的器具:刀、镊子、剪刀、酒精灯等 3、医用小平车:推送、放置培养基用,,,,(三)、培养室 应保持干净 条件:温度,因植物不同稍有差别,一般保持在25℃左右 光照,包括每日光照时间和光照强度,一般每日13h , 2000-3000lux 1、培养架 放置培养物,每层顶部装有灯管进行照明,可用灯管数量来调节光照强度 2、空调机 调节温度 3、配电板 设置电器和开关,用以管理室内的电源 4、时控器 自动开灯、关灯,,,,鉴定室 需备有高倍显微镜、倒置显微镜、相差显微镜、解剖镜、 驯化移植室 应备有温室、弥雾装置、荫棚、移植床、钵、盆、塑料布、草炭、蛭石、粗沙等,用于试管小植株的锻炼和移植。,,二、实验目的 1、了解培养基母液的配制原理 2、学习和掌握培养基母液的配制方法。,三、实验原理,在配制培养基前,为了使用方便和用量准确,常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。当配制培养基时,只需要按预先计算好的量吸取母液即可。 对植物外植体进行离体培养时,要依靠培养基提供生长所需的营养成分。不同材料对培养基的要求不同,适当的设计和选用培养基,对植物组织培养取得成功至关重要的。,(一)、培养基的成分及作用 在离体条件下,植物组织良好的营养要求,随植物种类而变化,培养基种类很多,但一般包括如下几部分: 1、无机营养成分 其中包括: 大量元素:氮、磷、钾、钙、硫、铁以及来源于水的氢氧元素 微量元素:硼、锰、锌、钼、铜、钴、氯等,,2、有机营养成分 为了能使组织很好的生长,在培养基里常常补加一种或一种以上维生素和氨基酸。 其中包括 维生素:硫胺素(VB1)、烟酸(VB3又称VBPP ) 、泛酸(VB5)、吡哆醇(VB6)、酸铵、钴胺素(VB12)、叶酸(VM又称VB11)、抗坏血酸(VC)等等.因培养基的种类不同,其种类和浓度不同 氨基酸:甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、 天冬酰胺、丙氨酸等等。因培养基的种类不同,其种类和浓度不同。,,肌醇:又称环己六醇,在糖类的转化中起作用。根据培养基的植物不同,是否添加。 天然有机物:如椰乳、酵母提取物、马铃薯煮汁也常用于植物组织培养,并表现出了良好的促进作用。,,3、琼脂:固化剂,使培养基凝固 4、糖(蔗糖) 糖在培养基的作用: 1)为细胞提供合成新物质的碳骨架 2)为细胞的呼吸代谢提供底物和能量 3)维持渗透压,,5、pH值:即酸碱度,培养的植物材料大多数要求弱酸性的环境,一般将培养基调整至pH5.6—5.8。常用0.1mol/l氢氧化钠或盐酸来调节培养基的pH。但是应该注意两点; 第一、经高温高压灭菌后,培养基的pH会下降0.2-0.5,故调整后的pH应该高于目标pH 0.2-0.5个单位; 第二、 pH的大小会直接影响到琼脂的凝固能力,一般pH 大于6.0时,培养基就会变硬,低于5.0时琼脂就不能很好地凝固。,(二)、激素 自然界中,植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物,它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分化、发育。在培养基中,其各种成分对培养物影响最大的最显著的就是激素。激素的种类、浓度、以及配比都会显著的影响愈伤组织的形成、不定根、不定芽的分化,胚状体的形成等。,,常用培养基的种类及其特点 培养基的种类 1、培养基,根据其态相不同分为固体培养基与液体培养基。 2、根据培养物的培养过程,培养基分为初代培养基和继代培养基。初代培养基是指用来第一次接种外植体的培养基。继代培养基是指用来接种继初代培养基之后的培养物的培养物。,,3、根据其作用不同,培养基分为诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。 4、根据其营养水平不同,培养基可分为基本培养基和完全培养基。基本培养基(就是通常称呼的培养基)主要有MS、White、 N6、B5 、改良MS、Heller、Nitsh、SH、 Miller等。完全培养基就是基本培养基的基础上,根据试验的不同需要,附加一些物质,如生长调节物质和其他复杂有机物质等。,,MS培养基是目前应用最多最普遍的培养基。无机盐的浓度较高,能保证组织培生长所需的矿物质营养。并且因为离子浓度高,在配制、贮存、消毒过程中,即使有些成分略有出入,也不致影响培养基中的离子平衡。,四、实验材料器材:电子分析天平、台秤、PH酸度计、高压灭菌锅、量筒 、烧杯、三角瓶、药勺、玻璃棒 药品:NH4NO3、 KNO3 、CaCl2·2H2O 、 MgSO4·7H2O、KH2PO4 、 KI 、 H3BO3 、 MnSO4·4H2O、 ZnSO4·7H2O、 Na2MoO4·2H2O 、CuSO4·5H2O 、CoCl2·6H2O 、FeSO4·7H2O、Na2-EDTA·2H2O 、肌醇 、烟酸 、 盐酸吡哆醇(维生素B6)、盐酸硫胺素(维生素B1) 、甘氨酸、1 mol/L NaOH 溶液、1 mol/L HCl溶液、琼脂,五、实验步骤,为什么要配制母液? 1)方便 2)准确(有些成分量太小) 3)母液要分类配, 否则有些成分混合一起会产生沉淀 以MS培养基为例:,,1、大量元素母液的配制 各成分按照表1培养基浓度含量扩大10倍,用天平称取,用蒸馏水分别溶解,按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到1000ml的瓶中,即为10倍的大量元素母液。贴好标签保存于冰箱中。 配制培养基时,每配1L培养基取此100ml。,-,表1 MS培养基大量元素母液制备,注意: (1) 配制大量元素母液时,各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才能混合,混合时应注意先后顺序。速度宜慢,边搅拌边混合。,,大量元素中防止CaCl2与其他无机盐产生沉淀,有事将其单独配制,在溶解CaCl2·2H2O时,蒸馏水需加热沸腾,除去水中的CO2,以防沉淀。另外,CaCl2·2H2O放入沸水中易沸腾,操作时要防止其溢出。,2、钙盐,2、钙盐,,3、微量元素母液的配制 MS培养基的微量元素无机盐由7种化合物(除Fe)组成。微量元素用量较少,按照表2-1配方,用分析天平称量。 配制培养基时,每配制1L培养基,取微量10ml,表2 MS培养基微量元素的配制,,4、铁盐母液的配制 目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物,必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便,又比较稳定,不易发生沉淀。配制方法同上,直接用蒸馏水加热搅拌溶解。 配制培养基时,配制1L取此液10ml。,,,表3 MS铁盐母液的配制,,注意: 在配制铁盐时,如果加热搅拌时间过短,会造成FeS04和Na2EDTA鳌合不彻底,此时若将其冷藏,FeS04会结晶析出。为避免此现象发生,配制铁盐母液时, FeS04和Na2EDTA应分别加热溶解后混合,并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色(约加热20 - 30 min),调pH值至5.5,室温放置冷却后,再冷藏。,,5、有机母液的配制 MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素。培养基中的有机成分原则上应分别单独配制。配制直接用蒸馏水溶解,注意称量时用电子分析天平。,,,表4 MS培养基有机物质母液的制备,,培养基的配制步骤 1、计量 根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量,计算公式:吸取量 ml=培养基中物质的含量(mg/L)×1000ml/母液浓度(mg/L)。 2、根据培养基配方, 用量筒或移液器量取所需要的各种元素的母液。,,,注意: ①在使用提前配制的母液时,应在量取各种母液之前,轻轻摇动盛放母液的瓶子,如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染,应立即淘汰这种母液,重新进行配制。 ②用量筒或移液管量取培养基母液之前,必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次。 ③量取母液时,最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上,量取1种,划掉1种,以免出错; ④移液管不能混用。,---------,3、称取6g琼脂,30g蔗糖备用 4、融化 将装有各母液的量杯倒入600~700ml的蒸馏水放在电炉上,加入琼脂,边加热边用玻璃棒搅拌,直到液体呈半透明状将其取下,加入蔗糖,蒸馏水定容到1000ml。,,5、调pH 用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH或HCl溶液,逐滴滴入溶化的培养基中,边滴边搅拌,并随时用精密的pH试纸(5.4~7.0)或酸度计测培养基的pH,一直到培养基的pH达到要求为止(在调制时要比目标pH值偏高0.2~0.5个单位,因为培养基在灭菌过程中由于糖等物质的降解,pH值会下降0.2~0.5个单位左右)。 注意: 调至时要用玻璃棒不停的搅拌,使其充分混合。 激素应在调节pH之前加入,因为有些激素是用酸或碱溶解的,在调节pH好之后加入会改变pH值。pH过酸或过碱对培养基均是不利的,会导致过软或过硬的结果,从而影响培养质量。,,6、分装 溶化的培养基应该趁热分装。分装时,锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5~1/4。每1L培养基,可分装25~30瓶。 7、灭菌 培养基各母液或MS培养即可高压蒸汽灭菌。 培养基中某些成分是热不稳定的,需要进行过滤灭菌。先将除去了不耐热物质的培养基其它成分经高压灭菌后置于超净工作台上冷却至40℃,再将过滤灭菌后的该化合物按计划用量依次加入,摇匀,凝固后即可使用。,,五、作业,1、配制母液时为什么要按顺序加入各药品?溶解CaCl2·2H2O时,为什么要将蒸馏水加热? 2、根据所给母液浓度、蔗糖、琼脂用量、pH值,按给出的培养基配方计算各种母液吸取量,填入下表。 培养基配方:MS+KT1.0+BA2.0+NAA0.2+蔗糖3%+琼脂0.7%,pH5.8。,,
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