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转基因拟南芥培养.ppt

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转基因拟南芥培养.ppt
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GFP转基因拟南芥的培养及荧光观察,GFP报告基因,发现: 绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP) 水母中发现发光蛋白(20世纪60年代),GFP报告基因,性质: 238氨基酸组成的单链多肽 在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光,有什么用呢?,蛋白质在活细胞中的准确定位及动态变化观察(分泌蛋白的分选、亚细胞定位),目的基因,目的基因tubulin拟南芥叶片表皮细胞、保卫细胞中微管骨架的分布情况根部细胞,目的基因与载体简介,pGMAP65-1::GFP植物表达载体的构建,,,导入农杆菌自我复制 浸染花粉转入拟南芥,,导入成功?,,转染成功?,tubulin,如何判定载体转化成功,植株内是否有目的基因的表达?——载体及植株的筛选,卡那霉素抗性培养基筛选,卡那霉素:抗生素影响植物细胞叶绿体和线粒体的蛋白合成,引起植株黄化死亡.卡那霉素能对转基因植物进行筛选实质上是通过卡那霉素抗性基因起作用的。转基因植物由于含有卡那霉素抗性基因而抑制了卡那霉素的作用,所以通过卡那霉素,转化体就很容易从非转化体中筛选出来。,卡那培养基上筛选GFP转基因幼苗,生长一个月左右的GFP转基因植株,体式荧光显微镜观察GFP转基因植株,生长两个月左右的GFP转基因植株,Confocal荧光显微镜观察GFP-tubulin 在气孔保卫细胞中的定位,材料与试剂,材料:GFP转基因拟南芥种子及幼苗试剂:MS培养基(wild type) ;MS卡那抗性培养基(GFP-MAP65);75%乙醇; 10%NaClO;无菌水。,种子消毒及播种实验流程,种子春化( 加蒸馏水放入4℃冰箱中过夜); 75%乙醇润洗一遍,再用75%酒精消毒1min(混匀,尽量将液体吸净,动作要快); 10%NaClO润洗一遍,再用10%NaClO消毒10min (混匀,尽量将液体吸净,动作要快); 无菌水洗五遍,用牙签将种子点在培养基表面(每皿4-5颗种子 尽量均匀); 封膜,做好标记,平放于培养架上培养。,注意事项: 严格无菌操作! 消毒过程动作要快! 枪头不要重复使用,物品不要拿出超净台! 点种时每个位置尽量只点一颗种子! 操作时尽量避免说话和人员走动! 注意小组内的配合和小组间的协调!,
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