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工具酶的发现和基因工程的诞生emma2013-7-31(修改).ppt

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工具酶的发现和基因工程的诞生emma2013-7-31(修改).ppt
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转基因蓝玫瑰,蓝色色素(蛋白质),蓝色色素基因(紫罗兰),在玫瑰细胞中转录翻译,,,,,,蓝色色素基因,玫瑰基因,,剪切,是否对玫瑰每个细胞重复进行上述步骤?,什么是转基因技术?,,操作环境:,生物体外,操作对象:,操作水平:,基本原理:,工程结果:,操作目的:,操作过程:,基因,分子水平,产生人类需要的基因产物,基因重组,让目的基因在受体细胞中表达,操作核心:,构建重组DNA分子,蓝色色素(蛋白质),蓝色色素基因(紫罗兰),在玫瑰细胞中转录翻译,,,,,,蓝色色素基因,玫瑰基因,基因工程的诞生,,理论基础,DNA是遗传物质的发现 DNA双螺旋结构的确立 遗传信息传递方式(中心法则)的认定,技术保障,最初从原核生物中分离,后来在酵母菌中也有发现(针对外来DNA,保护自身免受外源DNA入侵),4000种,常用200多种。,一、限制性核酸内切酶 — “分子手术刀”(简称限制酶),对DNA特定的核苷酸序列进行识别和切割,基因工程的基本工具,能够识别和切割DNA分子内一小段特殊核苷酸序列的酶 。,思考能否切割烟草花叶病毒上人们想要的目的基因?,,重播,EcoRI,识别GAATTC序列,并在G和A之间切开,,,限制酶在切断DNA时,可在切口处带有几个伸出的核苷酸,他们之间碱基正好互补配对,因此称这些片断为粘性末端。,5′,5′,3′,3′,专一性--识别特定的序列、有特定的切点,回文序列,作用结果:,粘性末端:错切,平末端:平切,下列有关基因工程中限制性核酸内切酶的描述,错误的是( ) A.一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B.限制性内切酶的活性受温度影响C.限制性内切酶能识别和切割RNAD.限制性内切酶可从原核生物中提取,AC,假设某病毒的一段序列如下图所示,其中某部位可被限制性内切酶A识别并切割,则限制性内切酶A识别的序列为以下哪个?CGTCATCGATGATGCAGCTCGCAGTAGCTACTACGTCGAG(A) ATGATG (B) ATCGAT (C) TGCAGC (D) CAGCTC,【答案:B】,(多选)某DNA分子中含有某限制性核酸内切酶的一个识别序列,用该限制酶切割该DNA分子,可能形成的两个DNA片段是( ),CD,注意:一般情况下,在获得目的基因的过程中,用一种或两种的限制性内切酶来酶切。,思考:,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制性核酸内切酶切几个切口?可产生几个黏性末端?,切两个切口,产生四个黏性末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割,会怎样呢?,会产生相同的黏性末端。,如果让两者的黏性末端通过氢键连接起来,是否就可以形成重组的DNA分子了?,基因工程的基本工具,2、DNA连接酶(T4噬菌体、大肠杆菌),两条链的骨架部分,形成磷酸二酯键,连接部位:,具有相同黏性末端的两个DNA片段连接起来,形成重组DNA分子。,结果:,限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键,只是一个是切开,一个是连接,注意:,,,氢键的断裂与形成与限制酶、DNA连接酶无关。,专一性?,,,用同一种限制酶来切割两种来源不同的DNA, 会产生相同的黏性末端。,思考:,用DNA连接酶连接两个相同的黏性未端要形成几个磷酸二酯键?,2个,用限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键?,4个,外源基因怎样才能运送到受体细胞?,需要“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体,3、基因载体(运载体),作为运载工具,将外源基因送入受体细胞。,作用:,质粒(最常用)、噬菌体和某些动植物病毒,种类:,基因工程的基本工具,(1) 运载体—质粒,细菌及酵母菌等。最常用的是大肠杆菌、农杆菌的质粒。,来源:,本质:,拟核(或染色体)外的小型双链环状DNA分子。,基因工程的基本工具,目的基因,受体细胞,,,,,,思考:实现该过程质粒必须满足什么条件?,,,基因工程的基本工具,条件:,⑶能在宿主细胞内自我复制并稳定地保存,⑴有一个或多个限制酶切点,可使外源基因插入其中,⑷具有某些遗传标记基因,以便进行筛选,⑵对受体细胞无害,启动子:位于基因的首端的一段特殊的DNA片断,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终获得蛋白质 终止子:位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断,能终止mRNA的转录 标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将有目的基因的细胞筛选出来,,基因表达载体的组成:复制原点+目的基因+启动子 +终止子+标记基因,质粒,思考,与只使用EcoRI相比较,使用BamHI和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么?,用两种限制酶防止目的基因与载体的自身环化。,1、只使用EcoRI,2、使用BamHI和HindⅢ,使用两种限制酶,防止载体与目的基因反向连接,基因工程的诞生,时间:,1972年,斯坦福大学 合成第一个人工DNA重组产物1973年,斯坦福大学 实现了细菌之间的性状转移——标志基因工程的诞生,20世纪70年代,不同生物的DNA能拼接在一起,基因工程的成功能说明哪些问题?,说明所有生物的DNA都具有相同的化学组成(四种脱氧核苷酸)和空间结构(双螺旋结构),一种生物的基因能够在另一种生物体内表达,说明基因是有遗传效应的DNA片段,具有一定的独立性,同时也说明各种生物共用一套遗传密码,有关DNA酶,将两个DNA片段通过磷酸二酯键连接。,DNA水解酶:DNA解旋酶:限制性核酸内切酶:DNA聚合酶:DNA连接酶:,将DNA水解成四种脱氧核苷酸,彻底水解时生成磷酸、脱氧核糖和含氮碱基。,使DNA解旋成单链,作用部位是碱基与碱基之间的氢键。(在适当的高温、重金属盐的作用下,也可使DNA解旋),以一条DNA链为模板,将单个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接成互补DNA链。,将DNA切成片断,作用部位是磷酸二酯键。,1、下图表示一项重要的生物技术,对图中物质a、b、c、d的描述,判断正误,A.a通常存在于细菌体内,目前尚未发现真核生物体内有类似的结构 B.b识别特定的核苷酸序列,并将A与T之间的氢键切开 C.c连接双链间的A和T,使黏性末端处碱基互补配对,×,×,×,练习:,1、科学家们经过多年努力,创立了一种新兴生物技术——基因工程,实施该工程的最终目的是A. 定向提取生物体的DNA分子 B. 定向地对DNA分子进行“剪切”C. 在生物体外对DNA分子进行改造 D. 定向地改造生物的遗传性状,【答案:D】,2、以下说法正确的是A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、载体必须具备的条件之一是:具有多个限制酶切点,以便与外源基因连接D、基因控制的性状都能在后代表现出来,【答案:C】,练习:,4、基因工程又叫重组DNA技术。假设以大肠杆菌质粒作为 基因载体,并以同一种限制性核酸内切酶切割载体与目的基因,将切割后的载体与目的基因片段混合,并加入DNA连接酶。连接产物至少有 种环状DNA分子(假设两两结合),它们分别是:,3,运载体与运载体相连、目的基因与目的基因相连、运载体与目的基因相连,3、人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基因,该抗性基因的主要作用是A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B.有利于对目的基因是否导入受体细胞进行检测C.增加质粒分子的分子量 D.便于与外源基因连接,【答案:B】,1.(2009·浙江3)下列关于基因工程的叙述,错误的是( )A.目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B.限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C.人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D.载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达,D,基因工程中,需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒,便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是-G↓GATCC-,限制酶Ⅱ的识别序列和切点是-↓GATC-。根据图示判断下列操作正确的是 A.质粒用限制酶Ⅰ切割,目的基因用限制酶Ⅱ切割 B.质粒用限制酶Ⅱ切割,目的基因用限制酶Ⅰ切割 C.目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割 D.目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割,A,
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