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重组蛋白的表达系统(详细版).ppt

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重组蛋白的表达系统(详细版).ppt
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重组蛋白表达系统,1.原核表达系统 2.酵母表达系统 3.昆虫细胞表达系统 4.哺乳动物细胞表达系统 5.转基因植物表达系统 6.转基因动物表达系统 7.表达系统的选择,一、 原核表达系统,原核表达系统发展完善、流程简单快速、成本低、产量高,对大部分蛋白来说都值得一试,尤其适宜于表达原核来源的以及不需要翻译后修饰的真核蛋白。,1.1 表达菌株,原核表达系统刚用的宿主菌有E. coli,Bacillus等。其中革兰式阳性的Bacillus更适宜在其周质空间分泌表达重组蛋白;革兰氏阴性的E. coli能够广谱表达异源蛋白。 大肠杆菌表达系统是目前发展最完善的重组蛋白表达系统。常用大肠杆菌菌株有BL21(DE3)、BL21(DE3)Star、B834(DE3)等,这些菌株都敲除了蛋白酶,并溶源了噬菌体DE3。DE3是的一种衍生λ噬菌体,带有噬菌体21抗性区和 lacI基因,lacUV5启动子,以及 T7 RNA聚合酶基因。这一区段被插入int基因,因此阻止了DE3在没有辅助噬菌体时整合到染色体上或从染色体切出。一旦形成DE3溶原状态,就只有受IPTG诱导的lacUV5启动子指导T7 RNA聚合酶基因转录,在溶原培养体系中加入IPTG诱导T7 RNA聚合酶生产,继而质粒上的目的DNA开始转录。同时,还有一些特殊设计的菌株以表达有特殊需要的重组蛋白,如甲硫氨酸营养缺陷型表达硒代甲硫氨酸蛋白,溶解性增强的菌株表达毒性蛋白,补充了稀有密码子的菌株表达真核蛋白等,表2给出了常用的大肠杆菌表达菌株。,表2 常用E. coli表达菌株,1.2 质粒载体,大肠杆菌表达系统采用质粒为表达载体,质粒上的重要元件包括复制子,启动子,终止子,多克隆位点,信号肽,融合标签,筛选标记等(图1)。原核表达载体已经发展得比较完善,有多种质粒可供选择(表4)。 复制子: 复制子决定着质粒载体在宿主中的拷贝数。通常情况下质粒拷贝数越高,重组蛋白的表达量就越高,但是高拷贝的质粒也会严重影响宿主的生长,质粒本身也不稳定,容易丢失和突变。克隆载体常采用拷贝数低、严谨复制的复制子,如pSC101;表达载体通常选用高拷贝的复制子,如pCoE1,pMBI(pUC),等。如果需要进行多个质粒的共转化,就要根据复制子的相容性选用不同复制系统的复制子,如pSC101和pUC共表达。,启动子: 表达重组蛋白时,我们需要考虑启动子的强弱、作用方式、调控方式和本底表达水平。表达载体通常选用强启动子以提高表达量,但弱启动子也有其优点,如降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。按照作用方式,启动子可以分为两类:组成型表达的启动子使宿主不停地表达重组蛋白,常用于工业生产,如σS等;诱导型表达的启动子使宿主仅在受到诱导(诱导剂、温度等)时表达目的蛋白,诱导型启动子使重组蛋白的表达容易控制,同时降低了外源蛋白对细菌生长的影响。,图1:大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱及多克隆位点,,早期大肠杆菌表达体系中,常见的启动子是lac和lacUV5。lac是一个弱启动子,很难使外源基因得到高表达。目前使用的含有需要小量共表达的蛋白(如分子伴侣,蛋白抑制剂等)的载体,有很多都采用了经典的lac启动子。 强启动子中,tac和trc是lac启动子的变体,其重组蛋白产率能够达到细胞总蛋白量的15-30%。araBAD启动子的诱导剂是便宜无毒的L-阿拉伯糖,本底表达量低,启动能力比tac稍弱。T7则是目前原核表达系统中最高效的启动子,pET表达系统即是以它为中心构建的。T7启动子来源于λ噬菌体,专一与T7启动子结合的T7 RNA聚合酶则被整合在宿主菌的基因组中。在λ噬菌体溶源的表达宿主菌,如BL21(DE3)中,lacI抑制T7 RNA聚合酶的表达,IPTG的加入可以解除这种抑制。当受到诱导时,T7 RNA聚合酶开始表达并结合在T7启动子上,启动重组蛋白的表达。T7 RNA聚合酶活性很高,转录速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍,使其下游的重组蛋白得到高效表达,其产率可以达到细菌总蛋白量的50%以上。T7lac启动子则在T7启动子下游加入了一个lac操纵子,其中带有一个常规启动子和lac阻遏蛋白的编码序列。lac阻遏蛋白可以抑制宿主合成T7 RNA聚合酶,并阻断T7 RNA聚合酶导致的目的基因转录,从而降低重组蛋白的本底表达水平。 PL、cspA启动子使宿主菌能够进行温度依赖型的表达。在温度敏感型突变体菌株中,PL等启动子使得宿主在30℃时抑制重组蛋白表达,而在42 ℃时诱导重组蛋白表达;cspA启动子则被高温(37℃)抑制,低温(10℃)启动。温度诱导型的启动子避免了诱导剂的引入,降低了使用成本,同时也降低了诱导剂对细胞的伤害。,终止子: 转录终止子按照是否依赖和不依赖ρ因子的作用分为两类,这两类终止子
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