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第十章 细胞增殖与调控.ppt

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,,第十章 细胞增殖与调控,本章教学内容,● 细胞周期及其物质时相变化 ● 细胞分裂主要事件 ● 细胞周期调控,细胞增殖(cell proliferation)意义,细胞增殖是细胞生命活动的重要特征之一,是生物繁育的基础。,◆ 单细胞生物细胞增殖导致生物个体数量的增加。 ◆ 多细胞生物由一个单细胞(受精卵)分裂发育而来, 细胞增殖是多细胞生物繁殖基础。 ◆ 成体生物仍然需要细胞增殖,主要取代衰老死亡的细胞,维持个体细胞数量的相对平衡和机体的正常功能。 ◆ 机体创伤愈合、组织再生、病理组织修复等,都要依赖细胞增殖。,细胞从一次有丝分裂结束开始到下一次有丝分裂完成所经历的有序过程。其间细胞遗传物质和其他内含物分配给子细胞。,,一、细胞周期概述,1、细胞周期,(1)概念,第一节 细胞周期及其主要物质时相变化,又称有丝分裂期(Mitosis),细胞沿着G1→S→G2→M→G1周期性运转,在间期细胞体积增大(生长),在M 期细胞先是核分裂,接着胞质分裂,完成一个细胞周期。,(2)细胞周期时相组成,间期(interphase):,M期(M phase):,G1、S、G2,1)不同细胞的细胞周期时间差异很大。 2)S+G2+M 的时间变化较小,细胞周期时间长短主要差别在G1期。 3)有些分裂增殖的细胞缺乏G1、G2期。,(3)细胞周期时间,细胞分裂后,某些细胞会离开细胞周期,去执行某种生物学功能或进行细胞分化。当受到适当刺激后,会重返细胞周期,进行增殖。如结缔组织中的成纤维细胞,平时并不分裂,当该组织部位伤害,则会马上返回细胞周期。周期中,细胞转化为Go期细胞多发生在G1期。,G0期细胞和终末分化细胞的界限有时难以划分,有的细胞过去认为属于终末分化细胞,目前可能被认为是G0期细胞。,(4)根据增殖状况,细胞分三类,1)连续分裂细胞(cycling cell),2)休眠细胞(Go细胞),3)终末分化细胞,分化程度很高,终生不再分裂。如大量的横纹肌细胞、血液多型核白细胞等。,2、细胞周期不同时相的主要物质变化,◆ G1期 ◆ S 期 ◆ G2期 ◆ M 期,,G1 期,与DNA合成启动相关;开始合成细胞生长所需要的多种蛋白质、RNA、碳水化合物、脂等;染色质去凝集。,DNA复制与组蛋白合成同步,组成核小体串珠结构。,S期,DNA复制完成,在G2期合成一定数量的蛋白质和RNA分子。,G2期,M期即细胞分裂期,真核细胞的细胞分裂主要包括两种方式,即有丝分裂(mitosis)和减数分裂(meiosis)。遗传物质和细胞内其他物质分配给子细胞。,M期,细胞周期各时相的主要物质变化,,,3、细胞周期同步化,使某一细胞群体中处于不同时期的细胞处于细胞周期的同一个时期,称为细胞周期同步化。,人工同步化,自然同步化,人工选择同步化,人工诱导同步化,,,,◆自然同步化,◆人工选择同步化,自然界存在的细胞周期同步过程,称为自然同步化。,人为地将处于不同时期的细胞分离开来,从而获得不同时期的细胞群体。,,有丝分裂选择法,密度梯度离心法,(1)有丝分裂选择法,处于对数生长期的单层培养细胞,细胞分裂活跃,大量处于分裂期的细胞变圆,从培养瓶(皿)壁上隆起,与培养瓶(皿)壁附着力减弱。轻轻震荡,处于分裂期的细胞即会从瓶(皿)壁上脱落,悬浮到培养液中,收集培养液,通过离心,即可获得一定数量的分裂期细胞。,细胞未经任何药物处理,细胞同步化效率高。,分离的细胞数量少。,优点,缺点,(2)密度梯度离心法,根据不同时期的细胞在体积和重量上存在差别进行分离。,方法简单省时,效率高,成本低。,对大多数种类的细胞并不适用。,优点,缺点,,◆人工诱导同步化,是指通过药物诱导,使细胞同步化在细胞周期中的某个特定时期。,(1)DNA合成阻断法 ─ G1/S-TdR双阻断法,(2)分裂中期阻断法,,又称:药物诱导同步化,,(1)DNA合成阻断法 ─ G1/S-TdR双阻断法,采用低毒或无毒的DNA合成抑制剂特异抑制DNA合成,而不影响处于其他时期的细胞进行细胞周期运转,从而将被抑制的细胞抑制在DNA合成期。目前采用最多的是DNA合成抑制剂TdR和羟基脲(HU),将细胞群阻断于G1/S交界处。,同步化效率高,几乎适合于所有体外培养的细胞体系。,优点,缺点,诱导过程可造成细胞非均衡生长。,,(2)分裂中期阻断法,通过某些药物如秋水酰素、秋水酰胺和nocodale等抑制微管聚合来抑制细胞分裂器的形成,将细胞阻断在细胞分裂中期。,优点,操作简便,效率高。,缺点,这些药物的毒性相对较大。,指某些特殊的细胞所具有的与标准的细胞周期相比有着鲜明特点的细胞周期。,◆ 爪蟾早期胚胎细胞的细胞周期 ◆ 酵母细胞的细胞周期 ◆ 植物细胞的细胞周期 ◆ 细菌的细胞周期,4、特异细胞周期,● 细胞分裂快,无G1期, G2期非常短,S期也短 (所有复制子都激活), 以至认为仅含有S期和M期。无需临时合成其它物质。 ● 子细胞在G1、G2期并不生长,越分裂体积越小。,(1)爪蟾早期胚胎细胞的细胞周期,● 细胞周期调控因子和调节机制与一般体细胞标准的细胞周期基本是一致的。,●酵母细胞的细胞周期与标准的细胞周期在时相和调控方面相似。 ●酵母细胞周期明显特点:,,(2)酵母细胞的细胞周期,酵母细胞周期持续时间较短。 封闭式细胞分裂,即细胞分裂时核膜不解聚。 纺锤体位于细胞核内。 在一定环境下,也进行有性繁殖。,● 植物细胞的细胞周期与动物细胞的标准细胞周期非常相似,含有G1期、S期、G2期和M期四个时期。 ● 植物细胞不含中心体,但在细胞分裂时可以正常组装纺锤体。 ● 植物细胞以形成中板的形式进行胞质分裂。,(3)植物细胞的细胞周期,● 慢生长细菌细胞周期过程与真核细胞周期过程有一定相似之处。其DNA复制之前的准备时间与G1期类似。分裂之前的准备时间与G2期类似。再加上S期和M期,细菌的细胞周期也基本具备四个时期。,(4)细菌的细胞周期,● 细菌在快速生长情况下,如何协调快速分裂和最基本的DNA复制速度之间的矛盾。,●前期(prophase) ●前中期(prometaphase) ●中期(metaphase) ●后期(anaphase) ●末期(telophase),一、有丝分裂(mitosis),第二节 细胞分裂各期主要事件,前期(prophase),◆ 染色质开始浓缩 (condensation)形成有丝分裂染色体(mitotic chromosome)。◆ 细胞骨架解聚,有丝分裂纺锤体 (mitotic spindle)开始装配。 ◆ Golgi体、ER等细胞器解体,形成小的膜泡。,注意: 分裂期中的染色体由两条染色单体(chromatid)构成。 在前期末,染色体主缢痕部位形成一种蛋白复合物称为动粒(kinetochore)。,间期动物细胞含一个MTOC,即中心体,在S期末,两个中心粒在各自垂直的方向复制出一个中心粒,形成两个中心体。当前期开始时,2个中心体移向细胞两极,并同时组织微管生长,由,两极形成的微管通过微管结合蛋白在正极末端相连,最后形成有丝分裂纺锤体。,前中期(prometaphase),◆ 核膜破裂成小的膜泡,这一过程是由核纤层蛋白中特异的Ser残基磷酸化导致核纤层解体。 ◆ 纺锤体微管与染色体的动粒结合,捕捉住每个已复制染色体的两个动粒,朝相反方向,保证与两极的微管结合;纺锤体微管捕捉住染色体后,形成三种类型的微管(星体微管、动粒微管、极性微管)。 ◆ 不断运动的染色体开始移向赤道板。细胞周期也由前中期逐渐向中期运转。,星体微管,动粒微管,极性微管,前中期(prometaphase),中期(metaphase),◆ 所有染色体排列到赤道板(Metaphase Plate)上,标志着细胞分裂已进入中期。,着丝粒微管动态平衡形成的张力,确保染色体正确排列在赤道板上的机制:,中期(metaphase),后期(anaphase),◆ 排列在赤道面上的染色体的姊妹染色单体分离产生向极运动(注意:姊妹染色单体分离成为独立染色体是从着丝粒处分开)。,后期(anaphase),末期(telophase),◆ 染色单体到达两极,即进入末期(telophase), 到达两极的染色单体开始去浓缩。 ◆ 核膜开始重新组装。 ◆ Golgi体和ER重新形成并生长。 ◆ 核仁也开始重新组装,RNA合成功能逐渐恢复,有丝分裂结束。,末期(telophase),,胞质分裂(Cytokinesis),1、动物细胞胞质分裂,◆ 开始于细胞分裂后期,在赤道板周围细胞表面下陷,形成环形缢缩,称为分裂沟(furrow)。分裂沟的位置与纺锤体极性微管和钙离子浓度升高的变化有关。 ◆ 胞质分裂开始时,大量肌动蛋白和肌球蛋白在中体处组装成微丝并相互组成微丝束,环绕细胞,称为收缩环(contractile ring)。收缩环收缩、收缩环处细胞膜融合并形成两个子细胞。,◆ 与动物细胞胞质分裂不同的是,植物细胞胞质分裂是因为在细胞内形成新的细胞膜和细胞壁而将细胞分开。,2、植物细胞胞质分裂,,,确保亲代细胞染色体能均等分配给子细胞,使亲、子代细胞保持遗传物质的稳定性。,有丝分裂的意义,1、减数分裂概念与过程,减数分裂是细胞仅进行一次DNA复制,随后进行两次分裂,染色体数目减半的一种特殊的有丝分裂。,(1)概念,二、减数分裂(Meiosis),,,分为细线期、偶线期、粗线期、双线期、终变期等五个阶段。,A.减数分裂I前期I中期I后期I末期I减数分裂间期 B.减数分裂Ⅱ前期Ⅱ中期Ⅱ后期Ⅱ末期Ⅱ胞质分裂,,(2)减数分裂过程,,,,,,,,,,,,,,,,染色质开始凝集,螺旋成细线状的染色体,细线的局部可见到念珠状的染色粒。细线期染色体虽已复制,但染色体仍呈单条线状,辨认不出两条染色单体。,A. 减数分裂 I,前期I:,分为细线期、偶线期、粗线期、双线期、终变期等五个阶段,1)细线期(leptotene stage),来自父母双方的同源染色体两两配对,形成联会复合体(Synaptonemal Complex,SC)。同源染色体联会的结果,染色体由单价体(univalente)变为条二价体(bivalents)。,2)偶线期(zygotene stage),偶线期的另一重要事件是合成在S期尚未合成的约0.3%的DNA(称为偶线期DNA,即zygDNA)。zygDNA在偶线期转录活跃,转录的RNA称为zygRNA。zygDNA转录被认为与同源染色体配对有关。,,,联会复合体位于2条同源染色体之间,沿纵轴方向形成,两侧为侧生成分(lateral element),宽约40nm,电子密度很高。两侧生成分之间为中间区(intermediate space),宽约100nm,电镜下为明亮区。中间区的中央为中央组分(central element),宽约30nm,为比较暗的区域。SC的中间有球形或椭球形重组节,直径约90nm,内含多种酶。侧生成分和中央组分之间有横向排列的纤维,大致成直角相连,称为L-C纤维,,长约60-70nm, L-C纤维之间距离为20-30nm,使SC的结构象一架梯子,呈扁平带状。SC主要由组蛋白、非组蛋白和RNA组成,含有微量DNA。,,染色体进一步缩短变粗形成四分体(tetrad),同源染色体中非姊妹染色体单体之间多处发生交叉(chiasma),结果使同源染色体间遗传物质发生交换重组,产生新的基因组合。,3)粗线期(Pachytene stage,此期也合成一少部分尚合成的DNA,称为P-DNA(大小约100-1000bp,用于编码一些与DNA切点和修复有关的酶类)。,,染色体继续缩短变粗。,4)双线期(diplotene stage),四分体开始出现端化,(terminalization),,,二价体显著收缩变粗,染色体螺旋化达到最高程度,并向核的四周边缘移动,在核内较均匀地分散开,同源染色体进一步相互排斥,端化继续进行,核仁、核膜开始消失。,5)终变期(diakinesis stage),,时间短,DNA并不复制。有些生物无此期。,中期I:,后期I:,末期I:,减数分裂间期:,染色体排列到赤道板(Metaphase Plate)上。,二价体中的两条同源染色体由纺锤体拉着移向细胞两极(注意着丝粒不分裂),结果,同源染色体发生分离;非同源染色体发生自由组合;染色体数目减半(但对DNA而言,数目未减半)。,染色体到达细胞两极并解螺旋化,核膜、核仁重现。形成两个子细胞。,后期I每一极只得到二价体中的一半,染色体数目由2n减为n,这时的每条染色体各含有1个着丝粒及2条 姊妹染色单体。所以,就染色体而言,经过第一次减数分裂发生了减半,但就DNA数目而言,则未减半。 (有丝分裂后期的每条染色体,都只相当于一条染色单体),A. 会发生非同源染色体重新组合和部分交换 B. 会发生同源染色体重新组合和部分交换 C. 非同源染色体重新组合,同时同源染色体会发生部分交换 D. 同源染色体重新组合,同时非同源染色体会发生部分交换,请思考: 减数分裂过程中:,过程与普通有丝分裂基本相同。,染色体到达细胞两极并解螺旋化,核膜形成,核仁出现。,,B. 减数分裂Ⅱ,前期II:,胞质分裂:,末期II:,后期II:,中期II:,时间短,有纺锤体形成。,染色体排列到赤道板上。,着丝粒分裂,姊妹染色单体彼此分离并开始移向细胞两极。,最后经胞质分裂形成4个子细胞,完成减数分裂全过程。,2、脊椎动物配子发生过程,,,,3、减数分裂特点,◆ 遗传物质只复制一次,细胞连续分裂两次,导致染色体数目减半。 ◆ S期持续时间较长。 ◆ 同源染色体在减数分裂期I(Meiosis I)配对联会、基因重组。 ◆ 减数分裂同源染色体配对排列在中期赤道板上,第一次分裂时,同源染色体分开,非同源染色体自由组合。,减数分裂前S期与有丝分裂前S期长度比较,,4、减数分裂的意义,◆ 确保世代间遗传的稳定性。 ◆ 增加变异机会,确保生物的多样性,增强生物适应环境变化的能力。 ◆ 减数分裂是生物有性生殖的基础,是生物遗传、生物进化和生物多样性的重要基础保证。,,有丝分裂与减数分裂的比较,Comparison of Meiosis and Mitosis,有丝分裂和减数分裂的意义及其主要区别。,思考题,时相物质变化相对稳定,由此保证了细胞周期有条不紊顺利进行,其原因何在?,讨论,——细胞周期各时相存在精确控制,都,一、细胞周期检控点(checkpoint),(1)细胞周期检控点概念,细胞周期调控的一种机制。其作用主要是为了确保细胞周期的每一时相事件能够有序、全部完成。,第三节 细胞周期调控,(2)细胞周期检控点及其作用,G1/S检控点(又称G1期检控点):,酵母—Start 动物细胞—Restriction Point,G2/M检控点(又称G2期检验点):,M纺锤体组装检控点:,S期检控点:,(Mitosis-promoting factor,Maturation-promoting factor),二、有丝分裂促进因子(MPF),1、MPF的发现,(1)细胞融合与超前凝缩染色体( PCC ),(Premature chromosomal condense),1970年Johnson等,将M期细胞分别与其他不同时期的间期细胞融合,发现间期细胞的染色体会提前发生形态各异凝集。该种染色体称为PCC。,提示:M期细胞存在诱导PCC的因子,人M期细胞与袋鼠(Ptk)G1、S、G2期细胞融合诱导PCC:提示M期细胞存在诱导PCC的因子。,Ptk G2期细胞染色体凝集为双线状,Ptk G1期细胞染色体提前凝集为细单线状,PtkS期细胞染色体凝集为粉末状,,,,(2)爪蟾卵子成熟过程,Marker et al,1971,I,III,II,Ⅳ期卵母细胞,卵细胞,受精卵,V,VI,注射实验表明:孕酮诱导卵母细胞成熟;成熟卵细胞质中,含有卵母细胞成熟的因子,称做MPF。,Ⅳ期卵母细胞,卵细胞,卵细胞,卵细胞,Ⅳ期卵母细胞,Ⅳ期卵母细胞,,芽殖酵母细胞周期,1) Leland Hartwell芽殖酵母实验,(3)酵母细胞周期基因研究,研究的同时, Hartwell还提出了checkpoint(细胞周期检验点)的概念。意指当DNA受到损伤时,细胞周期会停下来。,1960s Leland Hartwell以芽殖酵母为实验材料,利用阻断在不同细胞周期阶段的温度敏感突变株,分离出了几十个与细胞分裂有关的基因(cell division cycle gene,CDC)。如芽殖酵母的cdc28基因,在G2/M转换点发挥重要的功能。,裂殖酵母细胞周期,2) Paul Nurse 裂殖酵母实验,1970s Paul Nurse等人以裂殖酵母为实验材料,同样发现了许多细胞周期调控基因。,◆ 裂殖酵母cdc2、cdc25突变型在限制温度下无法分裂。 ◆ 裂殖酵母wee1突变型在限制温度下提早分裂。 ◆ cdc25和wee1都发生突变的个体限制温度下会正常分裂。,如:,cdc2和cdc28都编码一个34KD的蛋白激酶,促进细胞周期进行。而wee1和cdc25分别表现为抑制和促进CDC2的活性。,Cdc25 表达不足,细胞长得过长而不分裂;Wee1 表达不足,细胞很小就开始分裂了。,研究进一步发现:,◆ 1983年,Timothy Hunt首次发现,海胆卵受精后,其卵裂过程中有两种蛋白质的含量随细胞周期而出现显著变化:它们在间期开始合成,G2/M时达到高峰,M结束后突然消失,在下一轮细胞周期的间期又重新合成,故命名为周期蛋白(cyclin)。 ◆ 此后,在青蛙、爪蟾、海胆、果蝇和酵母中均发现类似的情况,各类动物来源的细胞周期蛋白mRNA均能诱导蛙卵的成熟。,(4)细胞周期蛋白的发现及其相关研究,◆ 1988年,M. J. Lohka 纯化了爪蟾的MPF,经鉴定由32KD和45KD两种蛋白组成,二者结合可使多种蛋白质磷酸化。,◆ 1990年,Paul Nurse进一步证明P32实际上是CDC2的同源物,而P45是cyclinB的同源物。,◆ 2001年10月8日美国人Leland Hartwell、英国人Paul Nurse、Timothy Hunt因对细胞周期调控机理的研究而荣获诺贝尔生理医学奖 。,2001年诺贝尔生理医学奖获得者,MPF是一种能使多种底物蛋白磷酸化的蛋白激酶,是M期中由周期蛋白Cyclin和周期蛋白依赖性激酶CDK 形成的复合物。,,p45,MPF= CDK1(p34cdc2)+cyclinB,CDK (Cyclin-dependent protein kinase),p32,,,,,2、MPF的生化实质,现认为,CDK-Cyclin是调控细胞周期各时相事件精密有序运转的引擎。CDK蛋白本身不具激酶活性, 它必须与周期蛋白(Cyclin)结合才具有激酶活性。 CDK蛋白为催化亚单位, Cyclin为激酶的调节亚单位。不同的周期蛋白与不同的CDK蛋白结合,构成不同的CDK-Cyclin复合体。不同的CDK-Cyclin复合体在细胞周期的不同时相表现不同的激酶活性。具细胞周期调控作用的CDK激酶(CDK-Cyclin复合体)可使某些下游蛋白质磷酸化,从而改变下游某些蛋白质的结构并启动其功能,进而实现细胞周期各时相事件精确调控。CDK激酶活性催化底物的磷酸化一般选择底物中某特定序列的某个Ser或Thr残基磷酸化。,CDK-Cyclin是调控细胞周期的引擎。不同的周期蛋白与不同的CDK结合,构成不同的CDK-Cyclin;不同的CDK-Cyclin在不同的时相表现活性,影响不同的下游事件。,,cyclin(调节)+ CDK(具酶活性)→MPF,MPF(mitosis-promoting factor,有丝分裂促进因子,为异源二聚体,是所有真核细胞有丝分裂起始的关键因子),3、CDK激酶(CDK-Cyclin复合物)的分子基础,,,CDK激酶(CDK-Cyclin复合物),酵母中有:Cln1、 Cln2、 Cln3、 Clb1-Clb6,1)种类,(1)周期蛋白(Cyclin),已发现周期蛋白(Cyclin)数十种,种类上具有多样性。,高等动物中有:周期蛋白A1、A2、B1、B2、B3、C、D1、D2、D3、E1、E2、F、G、H等。,只在G1期表达,并在G1期和S期转化中执行调节功能。如C、D、E、 Cln1、 Cln2、 Cln3 等。,各周期蛋白在细胞周期内的表达时期不同,功能多种多样。如:,在间期表达和积累,在M期才表现其调节功能,这类周期蛋白称为M期周期蛋白。如:周期蛋白A、B等。,G1期周期蛋白,M期周期蛋白,,2)分子结构,约含100个氨基酸残基,序列相当保守,介导周期蛋白与CDK结合。 不同周期蛋白框识别不同CDK,组成不同的Cyclin-CDK复合体,表现出不同的CDK激酶活性。,9个aa组成,特征序列为:RXXLGXIXN 主要参与由泛素介导的周期蛋白A和B的降解。 破坏框之后为一段Lys富集区,约40aa。 G1期周期蛋白不含破坏框。,与G1期周期蛋白更新有关。,a. 均有周期蛋白框(Cyclin box),b. 近N端有破坏框(destruction box),c. G1期周期蛋白C端含有PEST序列,部分周期蛋白分子结构特征,1、周期蛋白框介导周期蛋白与CDK结合。2、破坏框(Destruction box,RXXLGXIXN )(X代表任意氨基酸),破坏框之后为一段40个氨基酸组成的Lys富集区,破坏框主要参与由泛素介导的周期蛋白A和周期蛋白B的降解。3、PEST(脯、谷、丝、苏)与G1期周期蛋白的更新有关。,与CDK蛋白结合相关,,3)功能,为CDK激酶的调节亚单位。 CDK蛋白本身不具激酶活性,当其与周期蛋白(Cyclin)结合后, CDK激酶才表现激酶活性。具有激酶活性的CDK激酶可催化下游蛋白磷酸化,从而对细胞周期运转进行精密调控。,CDK1、 CDK2、 CDK3、 CDK4、CDK5、 CDK6、 CDK7、 CDK8,,1)种类,目前已发现并命名的CDK激酶有8种,即:周期蛋白依赖性蛋白激酶 (cyclin-dependent kinase,CDK),不同CDK激酶所结合的周期蛋白不同。因此,细胞周期中,不同CDK激酶执行的功能也不同。,(2)CDK激酶,某些CDK与周期蛋白的配对关系及执行功能的时期,注 Cyclin:细胞周期蛋白(又:细胞周期素)CDK:细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶,2)分子结构特点,均有CDK激酶结构域(CDK kinase domain)。 CDK激酶结构域中有一小段PSTAIRE保守序列,与周期蛋白结合有关。分子中的一些重要位点可磷酸化修饰,从而使其激酶活性得以调节。 细胞内存在的一些CDK激酶抑制物(CDKI)可负调控CDK激酶活性。,与Cdc2类似的CDK蛋白分子,,与周期蛋白结合相关,,Structure of a CDK (Human CDK2),CDKI,,,CDK kinasedomain,CDK激酶抑制因子(CDK inhibitor,CDKI)对细胞周期起负调控作用,分为两大家族:,② Kip (Kinase inhibition protein ),CDK激酶抑制因子(CDKI),如P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d,特异性抑制cdk4·cyclin D1、cdk6·cyclin D1复合物。,① Ink4 (Inhibitor of cdk 4 ),包括P21cip1 (cyclin inhibition protein 1)、P27kip1(kinase inhibition protein 1)、P57kip2等,能抑制大多数CDK的激酶活性。P21cip1还能与DNA聚合酶δ的辅助因子PCNA(proliferating cell nuclear antigen)结合,直接抑制DNA的合成。,P21cip1抑制CDK和PCNA,3)CDK激酶功能,不同种类的周期蛋白与不同种类的CDK激酶结合,构成不同的CDK激酶。不同的CDK激酶在细胞周期的不同时期表现不同活性,对细胞周期的不同时期进行调节。CDK激酶通过使下游某些蛋白质磷酸化,改变其结构,并启动其功能,从而实现细胞周期调控。CDK激酶催化底物磷酸化一般选择底物中某特定序列的某个Ser或Thr残基。,——对细胞周期正常运转起核心调控作用,周期蛋白含量在细胞周期中变化很大。它们根据细胞周期进程的需要而被诱导表达,而在不需要时被降解。,Cdk含量在整个细胞周期中变化不大,其活性除了受周期蛋白调节外,还受其他激酶和磷酸酶的磷酸化和去磷酸化调节。另外,Cdk活性还受变构抑制剂(如CDKI)、以及Cdk在细胞中的定位和运输等因素调节。,注意,注意,周期蛋白与CDK激酶结合只是CDK激酶表现其活性的先决条件,仅周期蛋白与其结合,并不能使CDK激酶激活,还需其它几个步骤修饰。,注意,讨论,如何理解周期蛋白激酶的多样性?,提示:注意结构上的多样性和功能上的多样性。,4、CDK-Cyclin复合物的多样性,目前已公认,CDK激酶对细胞周期起着核心性调控作用,不同种类的周期蛋白与不同种类的CDK激酶结合,构成不同的CDK激酶。不同的CDK激酶在细胞周期的不同时期表现出不同的活性,因而可对细胞周期的不同时期进行调节。,5、 CDK激酶对细胞周期的调控,例如:与G1期周期蛋白结合的CDK激酶在G1期起调节作用,与M期周期蛋白结合的CDK激酶在M期起调节作用。,,细胞周期的不同时期,不同的Cdk/周期蛋白复合物通过使特异的蛋白质(如转录因子)磷酸化,而开启或关闭某些基因的表达,或直接调节某些蛋白的活性,从而推动着细胞周期的运转。Cdk4、Cdk6等与周期蛋白D的复合物主要在G1期起作用;周期蛋白E与Cdk2形成的复合物作用于S期的起始;周期蛋白A与Cdk2的复合物不仅作用于S期的起始,而且其作用贯穿于整个S期;Cdk1(Cdc2)与周期蛋白A或周期蛋白B(其中主要是周期蛋白B)结合,为G2期到M期的过渡做必需。,,,(1) G1→S期转化的调控,现认为,哺乳动物细胞在实现由G1→S期转化过程中,主要受G1期周期蛋白依赖性CDK激酶所控制。,G1期周期蛋白主要有:周期蛋白D、E;或许还有A;与G1期周期蛋白结合的CDK激酶主要包括: CDK2、CDK4和CDK6等。,周期蛋白D主要与CDK4和CDK6结合,并调节CDK4和CDK6活性。 周期蛋白E主要与CDK2结合,并调节CDK2活性。 周期蛋白A也可与CDK2结合,并使CDK2表现出激酶活性。,在G1期,主要是周期蛋白D与CDK4和CDK6结合,并调节G1期CDK4和CDK6活性。,在哺乳动物细胞中,目前已知道Rb (retinoblastoma protein,成视网膜细胞瘤蛋白)是Cyclin-CDK激酶的底物,Rb是G1→S期转化的负性调节因子,在G1期的晚期阶段通过磷酸化而失活,使与之结合的转录因子E2F的作用被显现出来,进而促进有关基因的转录,使细胞周期由G1→S期转化。,Cyclin D与CDK结合使Rb释放结合的转录因子E2F,(2)细胞S期的调控,周期蛋白E与Cdk2形成的复合物作用于S期的起始。,周期蛋白A与Cdk2的复合物也作用于S期的起始,且其作用贯穿于整个S期。,周期蛋白E主要与CDK2结合,并调节CDK2活性。,周期蛋白A也可与CDK2结合,并使CDK2表现出激酶活性。,,每个细胞周期启动一次DNA复制,S期CDK激酶触发细胞进入S期,,,基因组有些区段在S早期复制,有些在晚期复制。一般规律是:活跃转录的基因在S初期复制,非转录区在晚期复制,着丝粒染色体复制最晚。早启动的复制起始点有组织专一性。,复制前复合物的形成与组装 (Pre-replication complexes, Pre-Rc),S期基因组复制需要在复制起始点构建复制前复合物Pre-Rc,以启动染色质复制(包括基因组复制)。复制过程结束后,这些Pre-Rc转变成复制后复合物Post-Rc(Post-replication complexes),使复制不再启动。之后,细胞进入G2期、并继续进入M期进行有丝分裂。,(以酿酒酵母Pre-Rc复合物的组装为例),① ORC先在染色体复制起始点形成“着陆垫”,是一组与复制起始点识别位置相结合的蛋白质,由6个蛋白组成。,复制前复合物(Pre-Rc)的形成,标志着基因组复制开始。,ORC(origin recognition complex, ORC),复制起始点识别复合物,酵母细胞中, Cdc6p 在G2期结束时合成,随后进入有丝分裂期,一直与染色质结合直到G1早期。染色质复制开始即G1末期时消失。其编码基因突变和过表达均能使基因组复制受抑。,② 然后由3种蛋白质参与组装构成Pre-Rc复合物,Cdt1 与DNA起始复制抑制因子geminin结合,阻止Pre-Rc复合物组装。,Cdc6p:,MCM蛋白(minichromosome maintenances protein)小染色体维持蛋白,◆ 属于RLF(复制执照因子,replication licensing factors)的主要成分。 ◆实验进一步证明,Cdc6、Cdt1等成分也是RLF的主要成分。 ◆ RLF与染色质结合从M末期直到S期开始前。随着DNA复制起始,RLF逐渐离开DNA。,Cdt1:,◆当有丝分裂结束进入G1时,Cdc6p 和Cdt1 逐渐在细胞内积累,在CDK作用下, Cdc6p 和Cdt1 与ORC结合。◆Cdc6p 和Cdt1 与ORC结合为MCM装配提供了平台,MCM与染色质结合使DNA获得复制资格,细胞于是进入S期。 ◆ Cdc6p 和Cdt1 脱离Pre-Rc复合物,S期表达的geminin 与Cdt1 结合阻止已经复制的DNA重新“点火”(refiring)。同时,CDK作用于Cdc6p ,使Cdc6p 离开细胞核,DNA复制起始。,③ Pre-Rc复合物组装过程,,每个细胞周期启动一次DNA复制,S期CDK激酶触发细胞进入S期,,,Cdc6是DNA复制起始调控中的一种重要蛋白,裂殖酵母Cdc6,非洲爪蟾Cdc6,人Cdc6,(A)电镜三维重构显示的一种古细菌的Mcm六聚体结构(俯面观,该复合体是由一种Mcm聚集而成的Mcm ) (B)电镜负染的人Mcm4/6/7复合体结构。 Mcm4/6/7复合体形成环状,DNA穿过复合体,形成念珠状结构。,Mcm聚合物结构,Cdt1分子结构及与Geminin片段形成复合体示意图,非洲爪蟾Cdt1,鼠Cdt1,p34cdc2蛋白在细胞周期中含量相对稳定,周期蛋白B含量则呈周期性变化。 CDK1激酶活性依赖于周期蛋白B含量的积累。 P34cdc2蛋白只有与周期蛋白B结合后才有可能表现出激酶活性。,CDK1激酶=p34cdc2(或p34cdc28 )+周期蛋白B/A,(3)G2→M期转化的调控,CDK1激酶是实现G2→M期转化的关键酶。即:CDK1(p34cdc2)与周期蛋白A或周期蛋白B(其中主要是周期蛋白B)结合,为G2期到M期的过渡所必需。,周期蛋白B一般在G1期的晚期开始合成,通过S期,其含量不断增加,到达G2期,含量达到最大值。随着周期蛋白B含量达到一定程度,CDK1激酶活性开始出现。到G2期晚期, CDK1激酶活性达到最大值,并一直维持到M期的中期。周期蛋白A也可与CDK1结合成复合体,表现出CDK1激酶活性。,细胞周期运转到细胞分裂中期后,M期的周期蛋白A和B将迅速降解,CDK1激酶活性丧失,细胞周期即从M期中期向后期转化。,(4)M期调控,主要表现为Cyclin-Cdk复合物对分裂中期→分裂后期转化的调控,中期,后期,末期,周期蛋白A和B的降解是通过泛素途径来实现的。,蛋白质泛素化降解的意义和途径?,请思考:,与一般蛋白质泛素化降解途径不同的是,M期周期蛋白A/B的泛素化降解需要后期促进因子(APC 或APC/C),即:后期促进因子选择性介导M期周期蛋白A/B与Ubiquitin结合,并使M期周期蛋白A/B通过泛素途径被降解,细胞由此实现由有丝分裂中期向后期转化。,Anaphase Promoting Complex, or cyclosome, APC or APC/C,APC各个成分在间期中表达,但其活性要到M期后受CDK激酶调节才能表现出来。,APC至少有8种成分组成,分别称为APC1-8,其中4种已被证明,分别为Cdc16、Cdc23、Cdc27、BimE。其余4种(APC2、APC4、APC5、APC8)仍待进一步证明。,请注意:,APC具有泛素化系统中E3酶的活性,◆ Mitotic Cyclin:,其降解意味着有丝分裂即将结束,即染色体开始去凝集,核膜重建。,维持姐妹染色单体粘连, 抑制后期启动。,APC主要选择性介导两类蛋白降解:,◆ Anaphase Inhibitors:,cohesin,,APC活化后降解Cyclin B的途径 :,,细胞周期蛋白的降解盒与降解途径,RXXLGXIXN,细胞进入有丝分裂后期之前,姊妹染色单体尚未完成在纺锤体两极定向,它们必须保持连接。姊妹染色单体之间的连接依赖于蛋白质复合物cohesin。有丝分裂后期的起始依赖于separase蛋白酶水解cohesin的一个亚基Sccl。细胞进入有丝分裂后期之前,抑制性蛋白securin结合着蛋白酶separase,使separase保持非活性状态。当所有染色单体都已正确连接到纺锤丝上后,APC/C 将securin连接到泛素分子上,通过泛素化途径将securin水解掉,separase继而恢复活性并水解Sccl,姊妹染色单体得以分离,从而驱使细胞进入分裂后期。,APC活化后降解Anaphase Inhibitors :,后期前、或纺锤体未与着丝点相连时,后期、或纺锤体与着丝点相连时,抑制蛋白,纺锤体组装检控点的作用是:在有丝分裂中期,当纺锤丝未能正确连接到染色体动粒上时,通过抑制securin活性,抑制姊妹染色单体分离,从而阻止细胞从有丝分裂中期向后期过渡,以保证复制后的染色体精确分配到子细胞核中。,纺锤体组装检控点在M期的调控机制,Securin:为APC(APC/C)的泛素连接酶),参与纺锤体组装检控点作用的蛋白有:Mad1、Mad2、Mad3(BubR1)、Bub1、 Bub3和Mps1等。,纺锤体组装检控点所作用的下游底物是:APC和Cdc20组成的复合物(APCCdc20)。 APC需要与Cdc20结合才能发挥对泛素连接酶securin的作用。,有丝分裂检控点复合体(mitotic checkpoint complex,MCC)由Mad2、 BubR1、 Bub3 与Cdc20所组成。该复合体能抑制Cdc20 与APC之间的相互作用,使姊妹染色单体不能分离,细胞被阻断在有丝分裂中期和后期交界处。,,,是一个由76个氨基酸残基组成的小分子蛋白,具有多种功能。在蛋白质降解过程中,多个泛素分子共价结合到含有不稳定氨基酸残基的蛋白质的N端,然后,被26S的蛋白酶体(proteosome)完全水解。,被降解蛋白质赖氨酸残基上单个或连续多个附着泛素分子的过程。,① 泛素(ubiquitin),② 蛋白质泛素化,蛋白质降解标记——泛素化,Ubiquitin:,泛素就像标签一样,被贴上标签的蛋白质通常就会发生降解。因此,泛素又被人称作“死神之吻”。,利用ATP能量使自身分子的Cys的-SH基与泛素分子上的 Gly残基形成高能硫酯键,使之能与E2结合。,③ 蛋白质泛素化系统,a. 泛素激活酶E1,b.泛素结合蛋白E2,使连接在E1分子上的泛素分子转移到欲降解的靶蛋白上。,与欲降解的靶蛋白结合。,c.靶蛋白泛素连接酶E3,蛋白质泛素化降解,,为多亚基结构,沉降系数为26S,由一个中空的20S催化核心(为圆柱体,由14种多肽,28个亚基组成,分4个环层,每层7个亚基,中间2层蛋白分别称为1-7,具酶活性;上下两层命名为1-7 ,无酶切活性)和两个19S的帽子(为调节部分, 又称PA700,由15个亚基组成)组成。蛋白酶体含量占细胞总蛋白的1%。,
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