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第十章 色层分离法1.ppt

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第十章 色层分离法,Chromatographic resolution 也称色谱法(chromatography) 色谱分离是分离科学的一次革命。,第一节 概述,,色谱分离,色谱分离是生物产品高度纯化的重要手段之一(多数生物产品包装前的最后纯化工艺);色谱分离技术已成为生物工程、生物化学、分子生物学及其他学科领域有效的分离分析工具之一;,色谱法的发展史,色谱法的诞生 常见的分离方式如过滤、蒸馏、沉淀、结晶、离心、萃取、膜分离等在分离复杂的混合物时就显得力不从心。 1903年,M. C. Tswett进行了分离植物叶中各种色素的实验。创立了色谱法。,,,,,,,石油醚,,,CaCO3颗粒,,,,植物叶石油醚提取物,石油醚,,,,,,,,,,,CaCO3颗粒,,1903年俄国植物学家Tswett实验示意图,,,,叶绿素 叶黄素胡萝卜素,,,,,石油醚,,,,,,碳酸钙 (固定相),,色素混合液,,,石油醚(流动相),1906年,Tsweet 发现色谱分离现象,,色谱柱,,,,,,,,,,,,,,植物色素分离图示,然而,在20多年时间里,他的新分离方法并没有受到科学界的重视。其中一个重要原因是德国著名化学家R. Willstätter对色谱法的排斥和不信任。 Willstätter(1915年获诺贝尔化学奖获得者)1913年在其名著“叶绿素的研究”中,称色谱法是一种“离奇的方法”,认为它不适用于制备工作,在吸附过程中,试样组分可能发生化学变化。他写道:“色谱法只能在试样很少的情况下使用,似乎不适合于制备目的……” Willstätter的观点,即过分强调制备工作,也反映出当时有机化学家的一种普遍态度。因此,茨维特的技术是超越其时代的。,1930年12月,奥地利22岁研究生E. Lederer到海得堡R. Kuhn领导的化学研究所研究类胡萝卜素。他对文献进行了仔细考察,从文献中了解到茨维特的色谱技术。在Kuhn的指导下,他用碳酸钙作吸附剂,在一小色柱中,成功地分离了-、-、-胡萝卜素,并发表了三篇论文,公布了他们的研究成果。这标志着色谱法的复兴。 Karrer在1937年,Kuhn在1938年,Ruzicka在1939年相继获诺贝尔化学奖。从此以后,色谱法得到普遍的公认,成为最有效的分离提纯手段。,色谱法的发展,1、历史 30年代 茨维特分离绿叶色素,产生固液吸附色谱 40年代 液—液分配色谱法 、TLC、纸色谱 50年代 GC出现使色谱具备分离和在线分析功能 60年代 推出了色谱-质谱联用技术(GC-MS) 70年代 HPLC出现使色谱分析范围进一步扩大 80年代 出现了超临界流体色谱法、毛细管电泳法 90年代 崛起的电色谱法,兼有毛细管电泳法与微 微填充柱色谱法的优点 21世纪 色谱科学将在生命科学等的前沿发挥他不可替代的重要作用,色谱法的发展 1931年,Kuhn、Lederer用氧化铝和碳酸钙分离了-、-、-胡萝卜素后才引起重视。Tswett的方法是借助于各组分在固定相中吸附能力的强弱不同而进行分离的,称为吸咐色谱adsorption chromatography。 1935年,Adams和Holmes 合成了离子交换树脂,并用于色谱分离,从而诞生了离子交换色谱法。,1941年A. J. P. Martin和R. L. M. Synge发明了分配色谱法(partition chromatography)。1952年获诺贝尔化学奖。 把氨基酸混合液注入到以硅胶作固定相的柱中,用氯仿作流动相,借助于氨基酸在硅胶中的水相和氯仿中溶解度不同而达到分离,1941年Martin和Synge提出用气体代替液体作流动相的可能性。 1952年James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气液色谱法gas-liquid chromatography。 1957年Golay开创了开管柱气相色谱法open-tubular column chromatography,即毛细管柱气相色谱法capillary column chromatography。 1956年Van Deemter等在前人研究的基础上发展了描述色谱过程的速率理论。 1965年Giddings总结和发展了前人的色谱理论。,1944年R. Consden、A. H. Gorden和Martin等发展了纸色谱。 1949年Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄层板使薄层色谱法(thin layer chromatography)得以实际应用,1956年E. Stahl对TLC的标准化、规范化及应用面做了大量工作并开发出薄层色谱板涂布器之后,才使TLC得到广泛地应用。 1959年Porath和Flodin提出了凝胶色谱法( gel chromatography )。 1967年Porath、Axen和Ernback成功地创立了亲和色谱法( affinity chromatography )。,20世纪60年代初,Giddings将气-液色谱理论用于液-液色谱,同时把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱, 于60年代末出现了高效液相色谱(HPLC)。 20世纪80年代初毛细管超临界流体色谱(SFC)得到发展,90年代未得到较广泛的应用。 20世纪80年代初由Jorgenson等集前人经验而发展起来的毛细管电泳(Capillary electrophoresis,CE),在90年代得到广泛的发展和应用。 同时集HPLC和CE优点的毛细管电色谱在20世纪90年代后期受到重视。,一、色谱分离,色谱分离(色层分离,层析分离,分析检测中又称色谱分析):利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差异(分子的形状和大小,分子的极性,吸附力,分子的亲和力,分子的分配系数等),使各组分以不同程度分配在两相中。当多组分混合物随流动相流动时,由于各组分物理化学性质的差异,而以不同的速率移动,使之分离。,,色层分离法是一组相关分离方法的总称,它的机理是多种多样的;但不管哪种方法都包括两个相:固定相和流动相。 固定相:通常为表面积很大的或多孔性固体。 流动相:为液体或气体。,色谱分离,①色谱分离都具有stationary phase和mobile phase 。 ②固定相是不动的,流动相对固定相作相对的运动。 ③被分离的组分与流动相和固定相有不同的作用力。这种作用力有吸附力,溶解力 ,离子交换能力等。在色谱分析中常用分配系数来描述组分对流动相和固定相的作用力的差别:K= Cs/Cm分配系数的差异是色谱分离的根本原因。,二、色谱分离的特点,分离效率高: 是所有分离纯化技术中最高的;尤其适合极复杂混合物的分离。 应用范围广: 从极性到非极性、离子型到非离子型、小分子到大分子、无机到有机及生物活性物质、热稳定到热不稳定化合物,尤其对生物大分子样品的分离是其它方法无法代替的。,色谱分离的特点(续),选择性强: 可变参数多,选择性极强,可选择不同的操作参数,适应不同样品的分离要求: 选择不同的色谱分离方法; 选择不同固定相和流动相状态; 可选用各种不同性状物质作固定相或流动相; 选择不同的洗脱方法; 选择不同的操作条件。,色谱分离的特点(续),高灵敏度的在线检测: 分离纯化中,根据不同的物理化学原理,采用不同高灵敏度检测器进行连续在线检测,保证在要求的纯度下有最高的产率。 快速分离: 采用高效细颗粒层析剂和高压液相色谱分离技术,保证高分离效率下的高分离速率。 过程自动化操作: 计算机的应用。,第二节 色谱分离的分类,,色谱分离的分类,按分离机理不同分类 按固定相及流动相的状态分类 按固定相形状分类 其他分类方法,一、按分离机理不同分类,按照溶质分子与固定相相互作用的机理不同可分为: 吸附色谱分离; 分配色谱; 离子交换色谱; 凝胶色谱; 亲和色谱。,1、吸附色谱分离,吸附色谱( Adsorption chromatography,AC ):混合物随流动相通过固定相(吸附剂)时,固定相对不同物质的吸附力不同使混合物分离的方法。 各种色谱分离中应用最早的一类;,吸附色谱分离,吸附作用力可以是物理吸附作用,也可以是化学吸附作用。 物理吸附的特点:选择性低,吸附速度较快,吸附过程可逆; 化学吸附的特点是:有一定选择性,吸附速度较慢,不易解吸。 物理吸附和化学吸附可以同时发生,在一定条件下也可以互相转化。,吸附色谱分离,传统吸附色谱以各种无机材料为吸附剂(氧化铝、硅胶、活性炭、氧化钛、氢氧化锌凝胶等),吸附过程包括多种作用力,作用机理较复杂; 新的吸附色谱技术:吸附剂一般为有机基质经化学修饰后制成,有较明确的作用机理,如疏水作用色谱、金属螯合作用色谱、共价作用色谱等。,2、分配色谱,分配色谱( Distribution chromatography,DC,液液色谱):固定相和流动相均为液相,利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。,分配色谱,根据分配原理进行分离操作方法有两种: 柱(纸或板)色谱分离法:固定相是将与流动相互不相溶的液体涂渍到载体上形成; 逆流分配:固定相和流动相都放在一组特别的分配管中,用逆流分配仪完成。,分配色谱,根据固定相和流动相的极性和非极性差别分为: 正相色谱(normal phase chromatography,NPC) :固定相为极性,流动相为非极性,当混合物随流动相通过固定相时,极性较强的化合物被保留,极性较弱的先被洗脱下来。 反相色谱(reversed phase chromatography,RPC) :固定相为非极性,流动相为极性,用于分离非极性或弱极性物质。,3、离子交换色谱,离子交换色谱(ion exchange chromatography,IEC) :基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换,混合物中不同溶质对交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。适合于离子和在溶剂中可发生电离的物质的分离,广泛用于生物大分子的分离纯化中。,4、凝胶色谱,凝胶色谱( Gel chromatography,GC):以凝胶为固定相,根据各物质分子大小不同而进行分离的色谱技术(利用生物大分子的相对分子质量差异进行层析分离的方法),又称为分子筛色谱(molecular sieve chromatography,MSC);空间排阻色谱(size exclusion chromatography,SEC) 主要用于脱盐、分级分离及分子量的测定。,(凝胶层析)Gel chromatography,凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料,通过特殊工艺合成的层析介质。目前已成为生物化学、分子生物学和生物制药在研究和生产中必不可少的分离介质。,凝胶色层分离法,凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段,它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点,因此广泛用于蛋白质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分离纯化,同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。,原理,凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒,凝胶颗粒的内部具有立体网状结构,形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后,各个组分就向固定相的孔穴内扩散,组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部,完全被排阻在孔外,只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动,它们经历的流程短,流动速度快,所以首先流出;而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部,经历的流程长,流动速度慢,所以最后流出。,凝胶层析的原理,凝胶装置图,色谱峰和分离结果,凝胶色谱,凝胶:一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构物质,其每个颗粒的细微结构就如一个筛子。,凝胶层析分离原理,5、亲和色谱,亲和色谱(affinity chromatography,AFC):利用生物分子间的特异性亲和力进行分离(即把与目的产物具有特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相,当含目的产物的混合物流经固定相时,即可把目的产物从混合物中分理出来),亲和色谱 (Affinity Chromatography),许多物质都具有和某化合物发生特异性可逆结合的特性。例如:酶与辅酶或酶与底物,抗原与抗体,凝集素与受体,维生素与结合蛋白,凝集素与多糖(或糖蛋白、细胞表面受体),核酸与互补链(或组蛋白、核酸多聚酶、结合蛋白)以及细胞与细胞表面特异蛋白(或凝集素)等。,,,,配体,蛋白质,蛋白质和配体复合物,,,,亲和层析的特点,纯化效率极高:亲和层析由于配体与待分离物质进行特异性结合,所以分离提纯的效率极高,提纯度可达几千倍 。,亲和层析的应用,1) 抗原和抗体(免疫亲和层析):抗原结合于亲和层析基质上,就可以从血清中分离其对应的抗体。 2) 激素和受体蛋白:目前已经用亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋白,如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、胰岛素等等多种激素的受体。,二、按固定相形状不同分类,柱色谱分离(column chromatography): 不同机理的色谱分离可在柱中进行; 具有进样量大和回收容易; 广泛用于生物样品的制备和工业生物产品的分离和纯化; 用作分析时,分辨率不如纸上色谱和薄层色谱高,按固定相形状不同分类,纸上色谱分离(paper chromatography ): 以滤纸为载体的分配色谱; 具有设备简单、操作方便、分离效率高、所需样品量少,广泛用于定性定量分析; 一般不用于制备和生产(因分离量少、回收困难、分离速率较慢);,按固定相形状不同分类,薄层色谱分离(thin layer chromatography): 固定相在玻璃平板上铺成薄层而进行分离; 是柱色谱、纸上色谱的结合, 操作简便、分离效率高、速率快、适合于不同分离机理的色谱分离; 主要用于分析,也可用于小量样品的制备; 按玻璃平板上所涂固定相的不同,可分为:薄层吸附、分配、离子交换、凝胶色谱。,三、其他分离方法,按流动相的物态不同分: 气相色谱(gas chromatography,GC)仅限于能够气化的物质,且主要用于分析。气相色谱包括气液色谱GLC、气固色谱GSC。 液相色谱(liquid phase chromatography,LPC)可分为液液色谱LLC、液固色谱LSC。 超临界流体色谱(supercritical fluid chromatography,SFC)是20世纪80年代中期发展起来的一种新的色谱分离技术,其流动相为超临界流体。,三、其他分离方法,按操作压力不同分为: 低压、中压、高压色谱分离。 按洗脱操作时展开方式不同分为: 洗脱展开法、前沿分析法、置换展开法,第三节 生物工业中的色谱分离,色谱和电泳是目前所知最好的两种分离方法,其塔板数可达百万数量级。在基因工程产品中,色谱分离占有核心地位。 色谱分离的规模 色谱分离方法的选择 分析色谱与工业色谱的比较,一、色谱分离规模,色谱分离规模相当小,按一次进样量的多少,分为4类: 色谱分析: 10mg 半制备(中等规模制备):10~50mg 制备(样品制备):0.1~1g 工业生产: 20g/d,二、色谱分离方法的选择,常按以下几方面来选择不同色谱方法: 目的产物的分子结构、物理化学特性及分子量的大小; 主要杂质 特别是分子结构、大小和理化特性与目的产物相近的杂质的成分与含量; 目的产物在色谱分离过程中的生理活性的稳定性。,二、色谱分离方法的选择,对于蛋白质、酶、核酸等生物大分子(分子量大、易失活、具有生物专一亲和性),较多选用多糖基质离子交换色谱、疏水作用色谱、凝胶和亲和色谱。对于生物小分子的代谢物(分子量小、结构和性质较稳定,操作条件不太苛刻),采用吸附、分配、离子交换色谱。,三、分析色谱 与制备色谱及工业色谱的比较,应用色谱技术范围不同: 分析色谱:流动相包括气相、液相,固定相形状有柱、纸、薄板。 制备和工业色谱:主要采用以液相为流动相的柱上色谱。,分析色谱与制备和工业色谱的比较,操作上的不同: 分析色谱:进样量越小越好,检测灵敏度越高越好,如微型毛细管柱色谱。 制备和工业色谱:进样量越多越好,色谱柱应大些,如大直径的径向色谱柱。,分析色谱与制备和工业色谱的比较,色谱分离理论上的不同: 理论塔板数的不同: 生物小分子,分离机理较明确,分离好坏与理论塔板数有关; 大分子,分离机理综合效果,分离好坏与理论塔板数无明显关系 分配系数的不同: 分析色谱:溶质浓度下降,一定温度下,K为常数; 制备和工业色谱:为提高产率,须提高单元操作进样量,样品浓度增大,K是温度的函数。,分析色谱与制备和工业色谱的比较,样品保留值与峰高不同: 分析色谱:同一样品保留值为常数,由保留值大小定性;峰高与组分浓度呈线性关系,峰高可作定量分析指标。 制备和工业色谱:保留值不仅随样品而变,且随浓度而变;保留值不定性,峰高不作定量分析的指标。,第四节 色谱分离的基本原理,,色谱分离的基础,各组分与固定相常存在一定的化学亲和力,其移动速率低于流动相的移动速率;若各组分对固定相的亲和力大小不同,各组分的移动速率就不同,使各组分在色谱柱内分层而得以分离。,,混合液加入柱上部,流入柱内,加入洗脱剂冲洗;各组分分层展开。,一、分配色谱,利用混合物中各组分在两种互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得以分离;其过程相当于连续性的溶剂抽提。,1、分配系数,分配色谱中: 固定相:一种多孔固体(支持剂或载体)吸附一种溶剂构成; 流动相:另一种流过固定相的溶剂(与固定相溶剂不相溶)。,分配系数,在一定条件下,一定量的溶质在两互不相溶的溶剂中达平衡时,溶质在两溶剂中的浓度之比为一常数——分配系数。混合物在流动相携带下通过固定相,溶质在两相间的平衡关系服从分配定律:Kd=C1/C2,分配色谱,在一定温度下,低浓度时,K为常数,分配关系为线性关系,相应的色谱过程为线性色谱;高浓度时,K为溶质浓度的函数,溶质在两相间分配为非线性关系,相应的色谱过程为非线性色谱。,2、阻滞因素,溶质在色谱柱(纸、板)中的移动速率与流动相移动速率之比——阻滞因数Rf。 Rf=(溶质的移动距离r)/(同一时间流动相的移动距离R)=速率之比 令As:固定相的平均截面积;Am:流动相的平均截面积。柱的总截面积为A=As+Am,阻滞因素(续),溶质能进行分配的有效截面积:Ac=Am+Kd•As 若流经柱的流动相体积为V,则溶质移动距离为:r=V/Ac=V/(Am+Kd•As) 对于流动相,Kd=0,流动相前缘移动距离为:R=V/Am,阻滞因素(续),由上述推知:Rf=Am/(Am+Kd•As) Rf大小取决于分配系数及装柱的紧密程度。 令柱中颗粒的空隙率为:=Am/ARf= /(+Kd(1- )) 0Rf 1 Rf值越大,溶质随流动相移动的速率就越大,溶质被洗脱的速率就越快。,3、塔板理论,色谱柱的分离效率也可用塔板理论来描述。 假设色谱柱分成若干段,每一段高度=一块理论塔板高度,则第i块塔板上溶质的重量分数为:fi=[n! /i!(n-I)!][1/(E+1)n-i][E/(E+1)i]随洗脱剂用量的增加,n增加,展开时间就增加,其高峰浓度逐渐降低,色带逐渐扩大。,二、吸附色谱,根据吸附剂(固定相)对不同物质的吸附力不同而使混合物分离。,吸附色谱分离,由吸附剂和吸附力不同,吸附色谱可分为: 无机基质吸附色谱(多种作用力) 疏水作用吸附色谱(疏水作用) 共价作用吸附色谱(共价键) 螯合作用吸附色谱(螯合作用) 聚酰胺吸附色谱(氢键作用) 离子交换色谱(静电引力) 亲和色谱(生物专一亲和力) 以上均为可逆吸附作用,基本原理是相同的。,1、等温曲线,吸附等温曲线:一定温度下,溶质分子在两相界面上进行的吸附达平衡时,它们在两相中浓度之间的关系曲线。,2、解离常数与分离因数,解离常数:分析分子间的相互作用力。,三、凝胶色谱分离,1、特点: 分离条件温和,蛋白质收率高,重现性好(凝胶为不带电荷的惰性物质,不与溶质发生任何作用); 应用范围广,分离分子量的覆盖面大(几百到数百万分子量); 设备简单,易于操作,周期短,层析剂不需再生可反复使用。 广泛用于生物大分子的制备和生产技术中。,凝胶色谱分离,,2、分离原理,根据各物质分子大小不同而进行分离的色谱技术; 凝胶柱的总体积V:V=V0+Vi+Vm式中:0、i、m分别表示凝胶颗粒间空隙、内部空隙、基质本身所占体积。 溶质分子充满柱的体积即洗脱体积为:Ve=V0+KdViKd——分配系数,某溶质分子可进入凝胶颗粒内部空隙的分数。,凝胶色谱分离,Kd=(Ve – V0 ) /Vi 当Kd=1时,溶质分子完全不被排阻,可自由进入所有凝胶微孔,最后流出柱外; 当Kd=0时,溶质分子完全被排阻于凝胶颗粒微孔外,最先被洗脱; 0Kd1时,中等分子,能进入部分空间。 Kd值大小决定物质的流出顺序。,第五节 柱色谱分离法,,一、概 述,工业规模的色谱分离多采用柱色谱分离法。各种色谱可在柱中进行,其实验装置和操作方法也基本类似。,二、层析剂,层析剂:用于色谱分离技术中的固定相或分离介质,由基质和表面活性官能团组成。 基质材料:化学惰性物质,与目的产物和杂质无结合作用; 活性官能团:根据所用色谱分离法选用或制取; 不同分离目的需要不同的分离材料。,1、层析剂(固定相)特性,不溶于流动相,有较好化学稳定性和机械强度; 有较大的表面积和孔隙度,粒度、孔径分布均匀; 较好的回收率和负载量,能达分离效率,重现性好; 有较好的热稳定性; 无毒性,不引起产物变性或失活; 成本低,价格合理。,2、层析剂种类,无机基质层析剂: 硅胶、氧化铝、活性炭、多孔玻璃等制成球性或无定形颗粒,可用于吸附和正相分配色谱。或经化学修饰、涂层改性,可制成不同分离机理的层析剂。,无机层析剂(续),羟基磷石灰: 一种晶体型磷酸钙,与生物体有很好相容性。 可用于生物大分子的分离与纯化,已成为水相体系中蛋白质、核酸和病毒等色谱分离应用最广的技术之一;,有机基质层析剂,基质颗粒可广泛选择单体和交联剂聚合进行化学改性处理,层析剂普遍有良好的选择性; 层析剂负载能力强,有较高的色谱容量; 化学稳定性良好,pH应用范围广; 不易产生不可逆吸附作用,较好保持生物活性。,有机基质层析剂:琼脂糖系,琼脂糖系: D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合而成的链状多糖; 有两种牌号:Bio-Gel A系(美国Bio Rad公司产品,交联琼脂糖凝胶)、Sepharose系(生化分离专用介质中型号最多,应用最大的最大系列产品)。 是生物大分子色谱分离操作最常用的基质之一; 适用于各种色谱分离技术;。,葡聚糖系Sephadex,由-1,6键相连的葡萄糖聚合物; 由环氧氯丙烷交联葡聚糖而成的珠粒(Sephadex),亲水性比Sepharose还强; 化学及热稳定性 也很好,可高压消毒,性质不变; 是经典的凝胶介质,有较高的选择性,多种规格的粒径,不同的分离范围及高的分辨率。 低交联度的,孔径较大的适于蛋白质与其他大分子的分离; 孔径小的主要用于脱盐、肽和其它小分子的分离。,有机基质层析剂,纤维素: -1,4键相连的D-葡萄糖的聚合物; 纤维素及其衍生物,用于蛋白质类物质的纯化。 聚丙烯酰胺凝胶: 由聚丙烯酰胺与交联剂共聚而成; 亲水性好,pH1~10内稳定,不为生物降解,在色谱分离中广为应用; 主要用于凝胶过滤法和凝胶电泳法。,三、装置,一般由进样、流动相供给、色谱柱、检测及流分收集器等部分组成。,1、进样及流动相供给装置,制备型和工业型高效液相色谱中,流动相供给部分一般包括:贮液罐、高压泵、液体混合室及梯度洗脱系统。进样量大需附带一输液泵。 高压泵是流动相供给的关键设备(分恒压、恒流两类),2、色谱柱,常用玻璃柱(可直接观察色带移动情况); 工业上大型色谱柱可用金属制造(其上可嵌一条玻璃或有机玻璃夹带,利于观察; 柱入口端有进料分布器,柱底部有支持固定相的玻璃棉或砂芯玻璃板。,2、色谱柱,一般情况下,柱的分离效率与柱长成正比,与柱直径成反比;l/d=20~30。 柱径的增加,可使样品负载量成平方的增加; 色谱柱的长度与许多因素有关:色谱分离的方法、层析剂的种类、容量、粒度、装填方法和均匀度等。,3、装柱,柱的装填好坏,对分离效果影响很大;柱装填不均匀,引起不规则流型; 目前采用匀浆装填技术:将层析剂与不超过层析剂用量的1份缓冲液调成浆料  边加边搅拌,一次加完 用几倍体积的缓冲液流过柱  平衡。,4、加试样,样品先用装柱用的缓冲液平衡,不夹带固体颗粒;加样时,先除去柱上过多的缓冲液,液面达床层顶面时,进行加样。,5、洗脱,可先用平衡缓冲液洗涤柱,除去结合杂质; 洗脱有三种方法: 恒定洗脱法——洗脱剂组成在洗脱过程中不改变; 逐次洗脱法——洗脱剂组成至少变一次; 梯度洗脱法——洗脱剂组成连续改变,使洗脱条件更有利于被结合物的解离。,6、检测器,由检测器连续监测柱底出口处液体中各组分的浓度变化,以了解样品中组分的分辨情况。 根据组分的物化特性(紫外吸收、荧光性、电导率、旋光性等),选用适当仪器,进行在线检测。,7、流分收集器,将底部流出的液体,每次按一定量分次收集的仪器。 有滴数式、容量式、质量式等若干种;,四、操作技术,,1、样品溶解与进样方法,色谱法分离纯化时,制备合适的样品溶液是成败的关键之一。 样品中应不夹带固体颗粒; 蛋白质类样品的溶解度有限,常加其他试剂,以提高其在水中的溶解度; 溶剂的性质也须适应所用的固定相,大量样品溶液导入柱后不马上扩散,集中在柱头达到“活塞式”进样的目的。,2、展开操作,样品上柱后,加入洗脱剂,使样品分离并收集产物;展开操作方式很多,具体选择取决于样品的性质、所需产品纯度、产率等。,常用展开方式,洗脱展开法:应用最广的。 样品上柱,加入一种不与固定相作用的流动相冲洗,洗脱中各组分与固定相作用力不同而分离,有顺序全部流出柱。以流出液体积对溶质浓度作图,得一系列的峰组成的曲线:每个峰对应于一个组分,峰面积与溶质含量成正比。,洗脱展开,,常用展开方式,前沿分析法: 样品溶液连续不断输入柱中(起流动相作用),样品溶液通过固定相时,各组分作用力不同而产生不同移动速率; 以溶质浓度对流出液体积作图,得一阶梯形线:每一阶梯表示至少增加一个组分。 一般不用于混合物分离,适于产品精制中痕量杂质的去除。,前沿分析法,,,,,,,,,,A,A+B,A+B+C,C,V,常用展开操作,置换展开法:与洗脱展开法差别不大,差别之处在于: 样品上柱后,用一种与固定相作用力极强的置换剂为流动相,去替代结合在其上表面的溶质分子,样品在置换剂推动下沿柱前进。 最先出的是作用力最小的,最后出的是置换剂本身。,置换展开法,,,,,,,,,,A,B,取代剂,C,V,五、径向色谱,为了提高色谱分离产量,须对色谱柱进行放大,放大方法: 保持直径不变,提高柱长; 保持柱长不变,加大柱径。 新发展了径向色谱柱新技术:色谱分离原理与膜分离过程的结合。,径向色谱柱,保持径向色谱柱直径不变,只增加径向色谱柱的长度,则可线性增大样品处理量。即样品的规模可在完全相同的色谱条件下直接放大,各组分的保留时间及分离情况与分析色谱基本一致。 在生物制剂、血液制品及基因工程产品等已广泛使用,结果优于轴向色谱柱。,径向色谱分离法,径向色谱柱的结构及原理如图所示。,径向色谱柱,采用径向流动技术,样品及流动相沿径向流动(从柱的圆周围流向柱圆心),可在较小的柱床层高度时,使用较大的流动相流速,同时在流动相保持较高的体积速度时反压降却降低(圆柱体的柱表面大于其横截面积)。,第六节 亲和色谱,,亲和色谱 Affinity Chromatography,AFC,亲和色谱: 基于固定相的配基与生物分子间的特殊生物亲和力的不同而相互分离的。 专门用于纯化生物大分子的色谱分离技术; 广泛用于酶、治疗蛋白、抗体、核酸等大分子及细胞、细胞器、病毒等超分子的分离纯化; 尤其对分离含量极少而又不稳定的活性物质最有效。,亲和色谱,优点: 高选择性; 操作条件温和; 有效保持大分子高级结构的稳定性; 活性样品的回收率也较高。 局限性: 不是任何生物高分子都有特定的配基; 针对分离对象,需制备专一的配基和选择特定的条件。,一、基本原理,属于一种吸附色谱,吸附作用主要靠生物分子对它的互补结合体(配基)的生物识别能力。生物体内相互作用的分子对:酶-低物或抑制剂,抗原-抗体,激素-受体,糖蛋白-凝集素,生物素生物素结合蛋白等。,亲和色谱基本过程,把具有特异亲和力的一对分子的任何一方作为配基,与不溶性载体结合,固定化,装入色谱柱; 把含目的产物的混合液作为流动相,在有利于固定相配基和目的产物形成络合物的条件下进入色谱柱; 产物被吸附,杂质则直接流出; 变换通过柱的溶液组成,促使配基与其亲和物解离,可得纯化的目的产物。,,,二、亲和层析剂,,基质(matrix),作用:固定配基,起支持作用的亲水性多孔载体。 亲和层析的基质应满足的条件: 具有亲水性,尽可能少的产生非特异性吸附; 具有可活化的大量化学基团用于连接配基; 机械强度好,有一定刚性,使用中体积收缩或膨胀不明显; 稳定性好,不易降解; 颗粒大小及孔径均匀,能容纳生物大分子进出,有适当流速。,亲和层析剂,亲和层析剂的制备: 载体(基质)的选择; 载体的活化; 配基的连接。 常规亲和层析剂都是以软质凝胶(葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等)作为载体材料。,亲和层析剂,琼脂糖基质亲和层析剂; 硅胶基质亲和层析剂; 合成高分子基质亲和层析剂。,三、亲和色谱操作中的洗脱方法,由于生物大分子与配基的作用形式是多种多样的,洗脱条件需通过实验获得。 洗脱方法有两类: 普通洗脱法: 专一性洗脱法:,亲和色谱操作中的洗脱方法,普通洗脱法: 通过改变溶剂或缓冲液的类型,改变缓冲液的pH和离子强度,改变洗脱温度,添加促溶剂等措施进行洗脱。,亲和色谱操作中的洗脱方法,专一性洗脱法: 溶液中的配基、抑制剂或半抗原等物质与亲和层析剂上的配基同时对生物活性物质产生竞争性结合,而达到洗脱的目的; 可获得很高的分辨能力; 专一性洗脱剂价格较昂贵,常与普通洗脱条件配合使用。,亲和色谱操作中的洗脱方法,若普通洗脱和专一性洗脱法都不能释出被结合的目的物质,可在缓冲液中添加温和的助溶剂,使目的物结构变形,降低柱上络合物的稳定性。,亲和色谱柱的洗涤、存放,洗脱结束后,亲和柱需继续用洗脱剂或缓冲液洗涤至无亲和物存在为止;用平衡缓冲液使亲和柱充分平衡;存于冰箱内(4°C)。,
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