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03哺乳动物组织基因组DNA提取.ppt

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03哺乳动物组织基因组DNA提取.ppt
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23 06 2020 1 GenomicDNAExtractionfromMammalTissue 哺乳动物组织基因组DNA提取 23 06 2020 2 一 实验目的 ExperimentalPurpose Aftertheexperimentdone studentsshouldbeabletoknowhowtoextractgenomicDNAfrommammaltissue andtorunanagarosegel 1 掌握动物基因组DNA提取的操作方法 2 掌握琼脂糖凝胶电泳的操作的方法 23 06 2020 3 二 实验原理 ExperimentalPrinciple Intheproceduredescribedhere thedetergentsSDS sodiumdodecylsulfate areaddedtodenatureproteinsandsolubilizelipidsinmembranesleadingtocelllysis ThecelllysateisoftentreatedwithenzymesthathydrolyzeRNAandproteins 本实验利用去垢剂SDS 十二烷基磺酸钠 是为了使蛋白变性并溶解细胞膜中的脂质从而导致细胞裂解 而细胞裂解物又常用蛋白酶K和蛋白进行水解处理 23 06 2020 4 Thisisgenerallyfollowedbyphenolofphenol chloroformextractiontoremovetheremainingproteins whichwilleitherentertheorganicphaseor ifdenatured appearattheinterphase Chloroformtreatmentisusedtoremovethephenol andalcoholprecipitationconcentratestheDNAwhileremovingnucleotides aminoacids andlow molecular weightoligonucleotidesandpeptides 随后用酚 氯仿进行抽提 以去除残留的蛋白质 这时蛋白质将进入有机相 或者假如己变性的话将呈现在有机相与水相之间 氯仿处理是为了去除苯酚 而乙醇沉淀处理则可以浓缩DNA 同时去除核苷酸 氨基酸以及低分子量的寡核苷酸和肽 23 06 2020 5 Asafurtherprecaution ethylenediaminetetraace ticacid EDTA isinclude edinthebufferstochelateMg2 Thiswillreducedeoxyribonuclease DNase activitybecauseoftheMg2 requirementoftheseenzymes 为了进一步保护DNA样品的完整性 通常需要在缓冲液中添加乙二胺四乙酸 EDTA 以整合Mg2 这样将会减少脱氧核糖核酸酶 DNase 的活性 因为该酶必须在有Mg2 存在时才会起作用 23 06 2020 6 TheprotocoldescribedhereresultinDNAthatiseasilycutwithrestrictionenzymesand therefore isusefulforSouthernHybridizationstudies IftheDNAistobeusedtoconstructaclonebank highermolecularweightDNAisdesirable sothevortexstepshouldbeeliminated 本实验方法分离得到的染色体DNA样品易被限制酶切割 因此 较适用于Southern杂交的研究 如果所制备的基因组DNA是用于构建克隆文库 要求得到较大分子量的DNA 则必须省略其中的振荡步骤 23 06 2020 7 三 试剂与器材 Reagentsandapparatus InstrumentsHighspeedrefrigeratedcentrifuge 高速冷冻离心机 Glasshomogenizer 玻璃匀浆器 ElectrophoresisSystem 电泳系统 Ultraviolettransilluminator 紫外透射仪 Ultracoldstoragefreezer 超低温冰箱 Autoclave 高压灭菌锅 Pipettes 微量加样器 Electronicbalance 电子天平 Acidometer 酸度计 23 06 2020 8 MaterialLiverofmice 23 06 2020 9 Reagents Tris SDS EDTA HCl NaOH Sodiumacetate Aceticacid Phenol Chloroform Ethanol Isoamylol TEbuffer ProteaseK RNaseA Agarose DNAmolecularweightmarkers Boricacid Sugar Bromophenolblue Fluorescentdye Gelview 23 06 2020 10 四 实验步骤 ExperimentalProcedures 冰浴处理生理盐水玻璃匀浆器冰冷的生理盐水清洗配制工作液处死小鼠取出肝脏组织匀浆液酶解液2ml匀浆液组织细胞液玻璃匀浆器匀浆移至1 5ml离心管5000r min30 60s加400ul吹散加400ul离心无菌水酶解液水浴处理 55 12 18h 23 06 2020 11 四 实验步骤 ExperimentalProcedures 等量分装在两支离心管内加入20ul的RNase加入等体积 提取液4 10min酶解样品待抽提的样品抽提静置离心配制TE缓冲液加等体积 提取液500ul10000r min离心10min4 10min移出水相至离心管抽提静置10000r min离心10min加1 10加2倍放入离心移出水相NaAc无水乙醇 20 1 2h12000r min离心15min加入超低温冰箱融化 离心弃上清液洗涤12000r min离心15min干燥4 75 冷乙醇离心弃上清液加TE存放DNA 23 06 2020 12 四 实验步骤 ExperimentalProcedures AgaroseGelElectrophoresis Preparationofthegel制备0 3 琼脂糖凝胶LoadingDNAsamplesDNAsamples16 l Loadingbuffer4 lGel电压120VGelphotography 23 06 2020 13 IlluminatethegelwithUVlightandthentakepictures Bycomparingproductbandswithbandsfromtheknownmolecular weightmarkers youshouldbeabletoidentifyanyproductfragmentswhichareoftheappropriatemolecularweight 通过紫外透射仪检测凝胶 然后获取图片 并将产物条带与已知分子量的标淮条带进行比较 便可以对合适分子量大小的产物进行鉴定 23 06 2020 14 五 实验结果 experimentalresults
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