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细胞结构成本的离心分离技术.pdf

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1 1.离心技术的基本概念 2.离心机转头分类 3.离心的基本方法 4.细胞结构成分的离心分离方法 离心分离技术 2 1. 离心技术的基本概念; 2. 决定离心行为的两个因素和“三要 素”; 3. 沉降系数、离心力和什么因素有关; 4. 离心的基本方法和适用范围; 5. 细胞结构成分的离心分离方法。 学习目标 3 一 .离心技术 (Centrifuge) 利用 溶液 中 颗粒密度、大小等特性 ,用旋转产生的 离心力 使不同特性颗粒从溶液中分离并沉降,从而 达到分离、浓缩、提纯和鉴定的目的,称为离心技 术。 * 分离细胞或其他的悬浮颗粒; * 从组织或细胞匀浆中分离细胞器; * 分离病毒和大分子,包括 DNA、 RNA、蛋白质和脂类。 4 什么是离心力? 圆周运动的物体 在旋转过程中产 生的 背向旋转轴 的运动力。 5 溶液和设备: 离心机、离心介质 颗粒的属性: 颗粒大小、密度等特性 6 决定离心行为的主要因素 颗粒的沉降系数 相对离心力 离心时间 离心分离首先需要知道的 “三要素” 7 8 1.沉降系数( S ):重要指标 颗粒在单位离心力的作用下的移动速度 dx/dt w2x dx: 颗粒与转轴中心的距离 dt:颗粒沉降所需时间 w: 角速度 X: 转子半径 s(秒) = 2r 2(p-  m) = 9 r: 颗粒直径 p : 颗粒密度 m : 溶液介质密度  : 溶液介质粘度 S =1 10-13s 决定沉降速度的因素: 颗粒大小 ; 颗粒密度 ; 溶液介质密度和粘度 9 离心分离时,作用在悬浮颗粒上的力常用 RCF数值 表示,即同一颗粒在离心时的离心力同地球重力相 比较后得到的值。 RCF(g)=离心力 /重力 = mw2x/mg=w2x/g = 1.12r(RPM/1000)2 r: 旋转中心轴至转头内离心管某一部位 的半径 RPM( rounds per minute, 转速 ): 转头 旋转的次数 2.相对离心力( RCF):重要指标 10 3.离心时间 颗粒经过溶液形成沉淀所需要的时间 t=K/S K: 表示转头离心效力的指标, 与转速平方成反比 。 离心机公司提供最高转速时的 K值。 K值越小越好,效力越高。 S:沉降系数 离心时间由离心效力和沉降系数决定 11 RCF1 t1= RCF2 t2 沉降离心中的两个因素 RCF, t 例:沉降某颗粒需 10 000gmin 10 000g 1min 2 000g 5min 12 1.离心技术的基本概念 2.离心机转头分类 3.离心的基本方法 4.细胞结构成分的离心分离方法 学习目标 13 二 .离心设备:离心机及离心管 4.温度控制 (冷却设备) 1. 转头 (马达) 3.离心腔 (真空设备) 2.控制系统 14 离心机分类 常温、低温; 台式、立式; 低速、高速、超速 低速: 6800g(细胞级) 分离 >10000S的细胞及细胞 器 高速: 17,700- 50,400g(亚 细胞级) 分离 >100S的颗粒,包括部 分细胞器及病毒 超速: 90,400- 694,000g (分子级)离  m )。 离心时间 (t), 不能使所有颗粒都沉到管底。 24 密度梯度离心 -等密度梯度离心法 ( isodensity centrifugation) 原理: 离心时采用 包括各种颗粒密度范围的梯度介质 , 被分离颗粒达到与其相同的密度介质时不再移动,形成 一系列区带,然后从管底收集。 25 用途: 分离有 密度差异 的颗粒 ,适用于 病毒、 DNA、 RNA、 蛋白质等。 特点: 密度 较高 介质 ,陡度大,介质的最高密度应 大于被分离 组分的最大密度 (p< m )。 所需的 力场 通常比速率沉降法大 10~100倍, 往往需要高速或超速离心。 26 1.离心技术的基本概念 2.离心机转头分类 3.离心的基本方法 4.细胞结构成分的离心分离方法 学习目标 27 四 .细胞结构成分的分离 1.细胞沉淀 2.细胞破碎 3.细胞结构成分的分离-离心技术 4.分离细胞器的鉴定和评价 28 1. 介质密度为 1g/ml; 2. 一般细菌和动物细胞密度为 1.08-1.12g/ml, 病毒密度为 1.18-1.31 g/ml。 3. 相对离心力 (g)和离心时间( min)决定沉降 材料 大小 (m) 离心条件 (离心力,离心时间) 动物细胞 10-60 200-500g 5-15min 人红细胞 6- 8 500g 5-15min 细菌 1-10 500-6000g 10-15min 病毒 0.02-0.03 30000-40000g 20-30min 1.细胞沉淀( cell pellet) 29 2.细胞破碎 * 渗透压冲击 * 超声波振荡 * 机械力研磨或剪切 * 反复冻融 原则:只需破碎细胞膜,保留完整细胞器 30 3.细胞结构成分的分步分离 一系列的差速离心+密度梯度离心 差速离心:分离细胞器 梯度离心:纯化细胞器 31 4.离心方法的选择 匀浆物中各类细胞器大小不同: 差速离心 上清中各类细胞器大小有差别: 速率区带离心 上清中各类细胞器密度有差别: 等密度离心 根据分离细胞器的性质: 32 密度梯度离心 梯度离心需要的设备 离心机:低速、高速、超高速 转头: 水平、固定角 、 垂直 介质: 蔗糖 , Ficoll, Percoll, Accudenz (Nycodenz), Metrizoate 介质的梯度形成装置和收集装置 33 5.分离细胞器的鉴定和评价 ( 1)形态鉴定:光镜或电镜 ( 2)生化分析:细胞器特异的标志酶 34 (2)生化分析:细胞器特异的标志酶 细胞器 标志酶 细胞核 NAD合成酶、 DNA聚合酶 线粒体 细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶、单胺氧化酶 溶酶体 酸性磷酸酶、 -半乳糖苷酶 过氧化物酶体 过氧化氢酶、尿酸氧化酶 内质网 葡萄糖 -6-磷酸酶、细胞色素 P450 高尔基体 -半乳糖苷转移酶 细胞膜 5’-核苷酸酶、 Na/K-ATP酶 35 6.举例 :细胞核分离 原理: 细胞核特征:体积大,沉降系数大; 密度高,可通过浓蔗糖,分离容易。 分离设计: •细胞破碎 (机械匀浆,渗透溶胀,表面活性剂), 释放细胞核,光镜鉴定释放效果。 •离心 ,光镜鉴定分离效果 36 1. 离心技术的基本概念; 2. 决定离心行为的两个因素和“三要 素”; 3. 沉降系数、离心力和什么因素有关; 4. 离心的基本方法和适用范围; 5. 细胞结构成分的离心分离方法。 学习目标 37
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