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WB检测全攻略.docx

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1、WB检测全攻略Western Blot, 于任何一个科研君都不陌生,但是, 甚么 人的 短、跑胶快、成像 影辣么好看活生生的羡慕,嫉妒,hen ( 哼 ) ,足足被甩了几篇SCI⋯内情你知否?除了 精 化操作, 合适的 , 有呢?当然离不开你的 化 你 关 步 的步步 。本文旨在通 提供建 ,帮助您在短 、以更少的 端用 化 整得到 期 果,提升免疫印迹效果。 PS:科研是不断 步的 程,有不当之 ,望指正。何 蛋白印迹(WB)蛋白印迹也称作免疫印迹, 是一种被广泛 用并得到公 的。

2、技 , 用于 胞或 提取物中的蛋白表达水平。 一技 利用抗体与特定待 蛋白的 合, 定生物 本中的蛋白水平。 抗体与其靶点蛋白表位的精确 合可用于 蛋白 中具有高度特异性的氨基酸序列。一句 完WB:就是抗原抗体反 !Western Blot可以 :1. 从蛋白 混合物中 出目 蛋白 ;2. 定量或定性确定 胞或 中蛋白 的表达情况;3. 用于蛋白 - 蛋白 、蛋白 -DNA、蛋白 -RNA 相互作用后 分析。。

3、▲ WB涉及的 域▲ WB操作关键步骤以下,会从关键步骤入手, 我们将给出试剂和实验过程的建议, 逐一介绍每个步骤中的一些关键注意点以及给出对应优化后的图表,供大家参考一、裂解产物制备1. 组织裂解常见破碎组织的方法: 机械法、匀浆法、超声波破碎解、研磨法,反复冻融法等;实验室常用的破碎方法:1. 超。

4、声波;2. 电动研磨;3. 磁珠破碎法。(注意磁珠高速旋转时产生的热量比较多, 需提前把机器放在冰箱制冷)以上主要注意发热引起的蛋白变性和聚集,操作过程中尽量减少细节上的差异,这样才能保证实验结果的重复性比较一致。2. 细胞裂解一般裂解液包含以下几个组分 :1. 缓冲系统;2. 盐离子;3. 离液剂;4. 蛋白酶抑制剂;5. 还原剂▲根据目的蛋白选择合适的裂解液。

5、▲常见蛋白酶磷酸酶抑制剂二、凝胶电泳1. 加入足量的样品和分子量大小标记物SDS-PAGE根据蛋白电泳迁移率将其分离,迁移率是蛋白大小和电荷的函数。我们建议在预制Tris-Glycine小孔胶上样20-40 μ g全细胞裂解液或100ng 纯化蛋白,根据目标蛋白的表达量优化上样量。对于大分子量靶标,我们建议采用Tris-Acetate凝胶和相关缓。

6、冲液。应在待测样本附近的泳道始终加入分子量标记物,作为参考点。分子量标记物(或梯状条带)是已知分子量的纯化蛋白的混合物。采用预染色标记可以看见电泳过程中蛋白迁移的距离,随后确认经电转移至膜。采用生物素标记物可以看见膜上的梯状条带和抗体靶标。2. 选择合适的蛋白marker预染蛋白 marker 应用:? 实时监控 SDA-PAGE中的蛋白迁移? 检验 western 转膜效率? 对蛋白大小进行初略鉴定? 呈彩色且转膜效果好。

7、▲电泳凝胶制备参考浓度三、转膜1. 湿转移把蛋白从凝胶转移至膜上的湿转移是指把滤纸液中。使用此方法时,在浸没的情况下通过电泳转移至却的含 20% 甲醇的转移缓冲液中转膜,70V, 1.5- 凝胶 - 膜 - 滤纸“三明治”完全浸入缓冲0.2μ m 孔径硝酸纤维素膜,在冷小时。2. 半干转移把蛋白从凝胶转移至膜上的半干转移是指将浸满缓冲液的滤纸- 凝胶 - 膜 - 滤纸“三明治”系统,置于本应干燥的阳极和阴极板上。。

8、在这一系统中, 转移在桌面上进行, 在室温条件下约 15-60 子量蛋白时这一系统均运转良好, 相较于湿转移所需缓冲液更少,分钟。转移低分子量和高分但是在某些情况下会产生更高的背景染色。 (转膜时不离人,监测电流电压)3. 干转移把蛋白从凝胶转移至膜的干转移是指不额外加入缓冲液的系统, 因为阳极和阴极板系统中含有缓冲液基质。对于较大分子量蛋白,观察到信号差异最大,表明转移效率低。(注意: 在样本量有限或待检测蛋白低内源水平的情况下, 干转移方法会限制您分析的灵敏度。)。

9、▲ Trans Blot四、封闭建议转移之后迅速在Tris-BufferedSaline(TBS)中洗涤膜,以便移除残留的转移缓冲液,随后在室温条件下含5% 脱脂牛奶的Tris Buffered Saline和 Tween? 20 去污剂 (TBST) 中封闭 1 小时。这一封闭步骤有助于降低非特异性一抗结合并降低背景。应避免膜封。

10、闭时间过长,因为这会掩盖抗原表位,阻止抗体结合。封闭后在TBST 中洗涤 5 分钟。五、一抗、二抗孵育1. 加一抗与抗原结合? 一抗应在含 5% BSA 或 5% 脱脂牛奶的 TBST 缓冲液中稀释。? 一抗孵育时间会有很大的差别, 具体取决于研究人员采用的操作流程。 建议在 4℃ 过夜孵育一抗。(过夜孵育提高抗体结合)? 免疫印迹操作流程的另一个存在差异的方面是洗涤和稀释缓冲液。推荐抗体稀释缓冲液和洗涤步骤使用TBST。 (TBST 缓冲液产生更强的信号)2. 加二抗与一抗的结合? 建议在含 5%。

11、 脱脂牛奶的 TBST 中稀释二抗。? 因为脱脂牛奶的封闭要更强,所以基于BSA 的稀释比基于牛奶的稀释产生的背景明显更强。? 如果对免疫沉淀细胞裂解物进行免疫印迹实验, 考虑采用构象或链特异性二抗, 以避免 IgG 重链或轻链的信号。这个步骤的成败关键看试剂质量的好坏用的抗体不到位整个实验都白费有木有六、检测一般。

12、使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP 显色法。1. HRP-ECL发光法:将 A、 B 发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗,滤纸贴角吸干,反贴法覆于A、 B 混合液滴上,熄灯至可见淡绿色荧光条带(5min 左右)后滤纸贴角吸干,置于保鲜膜内固定于片盒中,迅速盖上胶片,关闭胶盒, 根据所见荧光强度曝光。 取出胶片立即完全浸入显影液中 1-2min ,清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影,清水冲净晾干,标定 Marker ,进行分析与扫描。2. AP-NBT/BICP 显色法:每片 NBT/B。

13、ICP 可溶解于30ml 水中,使用前将一片分装在30 个 EP 管中,每张3 9cm的膜取一管配成1ml 即可。将PBST或 TTBS 洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗,滤纸贴角吸干,反贴法覆于NBT/BICP 溶液液滴上,并用不透明物体(如报纸)遮挡光线,显色20s 后每 10s 观察一次,至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。背景深浅与一抗的质量及二抗的量有关,当然如果曝光时间长达半小时,出现背景是正常的。▲显色(干货是不是很受用) ,明明白白做实验,善其事前利其器,普通问题常规避,优化成功没问题。。

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