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3种艰难梭菌感染检测方法的比较.doc

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3 种艰难梭菌感染检测方法的比较 王丽志 陈丽丹 肖斌 甘燕玲 李林海 王前 南方医科大学南方医院检验科 中国人民解放军广州 总医院检验科 摘 要: 目的 评价3种艰难梭菌感染 (CDI) 检测方法的诊断效能, 为CDI寻找合适的诊 断方案。方法 收集中国人民解放军广州总医院 2016年5月 1 2月疑似 CDI的腹 泻患者粪便标本70 例, 采用3 种方法进行检测: (1) 培养法; (2) 酶联荧光法 检测艰难梭菌毒素 A/B (CDAB) 和谷氨酸脱氢酶 (GDH) ; (3) q-PCR 扩增艰难梭 菌特异性基因tpi和毒素基因 (tcd A/tcd B) 。以培养法的检测结果作为参考 标准, 计算 3种方法的诊断指标。结果 收集粪便样本 70例, 分离艰难梭菌 13 例 (18.57%) , 其中产毒株6例 (8.57%) 。 q-PCR法鉴定tpi基因阳性17例, 其 敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、诊断符合率分别为 92.31%、91.23%、 70.59%、98.11%、91.43%, 均高于GDH法 (84.62%、84.21%、55.00%、96.00%、 84.29%) (χ 2 =24.881, P0.1 为阳性。二者均按试剂说明书要求做定标和质控。 1.6 q-PCR 法检测粪便艰难梭菌和毒素基因 取180~220 mg 粪便标本, 参照粪便基因组 DNA提取试剂盒说明书操作步骤, 提 取基因组DNA (g DNA) 作为模板。采用Taq Man 探针法定性三重q PCR 检测tpi、 tcd A和tcd B的存在。10μL反应体系如下:2×Master Mix 5.0μL, 上下游引 物 (10μmol) 各0.3μL, 模板 (1 ng/μL) 1.0μL, 去离子水3.4μL。反应条 件:95℃预变性5 min, 95℃变性15 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸15 s, 40 个 循环后95℃15 s, 60℃1 min, 95℃15 s。结果判定标准: (1) tpi 和tcd B的 Ct≤40, 为产毒型艰难梭菌阳性; (2) tpi≤38, tcd B 无扩增, 为不产毒型艰 难梭菌阳性; (3) tpi 的3836 或No Ct, 为结果无效。所用引物见表 2。 表2 粪便q-PCR艰难梭菌tpi、 毒素基因 (tcd A/tcd B) 所用引物Tab.2 Primers for q-PCR of CD tpi and toxin gene (tcd A/tcd B) in stool specimens 下 载原表 1.7 统计学分析 实验数据用SPSS 20.0 进行数据分析, 3种检测方法的阳性率比较采用配对卡方 检验, 以 P<0.05认为差异有统计学意义, 并计算灵敏度、特异度、阳性预测值 和阴性预测值。 2 结果 2.1 3 种检测方法与参考标准检测结果 本实验共收集疑似艰难梭菌感染腹泻粪便标本 70例, 经过培养法分离获得 13 株艰难梭菌, 其中 6例携带毒素基因, 阴性标本 57例 (表3) ;CDAB 检测结果6 例为阳性, 3例灰区, 61例为阴性 (表4) ;70 例标本中20例GDH为阳性, 50 例阴性 (表3) 。根据荧光定量 PCR检测结果, tpi基因阳性标本共计 17例 (表 3) , 其中毒素基因 tcd A/tcd B双阳性7例 (表4) 。 表3 GDH及q-PCR检测 tpi与培养法结果的比较 Tab.3 Comparison of GDH and q-PCR detection for tpi with culture method 下载原表 2.2 联合检测与参考标准检测结果 q-PCR (tpi) 联合CDAB与GDH联合CDAB分别将产毒株培养作为检测标准进行比 较, 至少一种方法检测为阳性认为结果判断为阳性 (表5) 。 表4 CDAB, q-PCR检测 tcd A/tcd B与产毒株培养结果的比较 Tab.4 Comparison of CDAB and q-PCR detection for tcd A/tcd B with culture of toxin-producing strains 下载原表 表5 q-PCR与GDH联合 CDAB检测结果与产毒株培养比较 Tab.5 Comparison of q-PCR and detection of both GDH and CDAB with culture of the toxin-producing strains 下载原表 2.3 各个实验室方法单独及联合检测的诊断学指
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