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3种艰难梭菌感染检测方法的比较.doc

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3 种艰难梭菌感染检测方法的比较 王丽志 陈丽丹 肖斌 甘燕玲 李林海 王前 南方医科大学南方医院检验科 中国人民解放军广州 总医院检验科 摘 要: 目的 评价3种艰难梭菌感染 (CDI) 检测方法的诊断效能, 为CDI寻找合适的诊 断方案。方法 收集中国人民解放军广州总医院 2016年5月 1 2月疑似 CDI的腹 泻患者粪便标本70 例, 采用3 种方法进行检测: (1) 培养法; (2) 酶联荧光法 检测艰难梭菌毒素 A/B (CDAB) 和谷氨酸脱氢酶 (GDH) ; (3) q-PCR 扩增艰难梭 菌特异性基因tpi和毒素基因 (tcd A/tcd B) 。以培养法的检测结果作为参考 标准, 计算 3种方法的诊断指标。结果 收集粪便样本 70例, 分离艰难梭菌 13 例 (18.57%) , 其中产毒株6例 (8.57%) 。 q-PCR法鉴定tpi基因阳性17例, 其 敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、诊断符合率分别为 92.31%、91.23%、 70.59%、98.11%、91.43%, 均高于GDH法 (84.62%、84.21%、55.00%、96.00%、 84.29%) (χ 2 =24.881, P0.1 为阳性。二者均按试剂说明书要求做定标和质控。 1.6 q-PCR 法检测粪便艰难梭菌和毒素基因 取180~220 mg 粪便标本, 参照粪便基因组 DNA提取试剂盒说明书操作步骤, 提 取基因组DNA (g DNA) 作为模板。采用Taq Man 探针法定性三重q PCR 检测tpi、 tcd A和tcd B的存在。10μL反应体系如下:2×Master Mix 5.0μL, 上下游引 物 (10μmol) 各0.3μL, 模板 (1 ng/μL) 1.0μL, 去离子水3.4μL。反应条 件:95℃预变性5 min, 95℃变性15 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸15 s, 40 个 循环后95℃15 s, 60℃1 min, 95℃15 s。结果判定标准: (1) tpi 和tcd B的 Ct≤40, 为产毒型艰难梭菌阳性; (2) tpi≤38, tcd B 无扩增, 为不产毒型艰 难梭菌阳性; (3) tpi 的3836 或No Ct, 为结果无效。所用引物见表 2。 表2 粪便q-PCR艰难梭菌tpi、 毒素基因 (tcd A/tcd B) 所用引物Tab.2 Primers for q-PCR of CD tpi and toxin gene (tcd A/tcd B) in stool specimens 下 载原表 1.7 统计学分析 实验数据用SPSS 20.0 进行数据分析, 3种检测方法的阳性率比较采用配对卡方 检验, 以 P<0.05认为差异有统计学意义, 并计算灵敏度、特异度、阳性预测值 和阴性预测值。 2 结果 2.1 3 种检测方法与参考标准检测结果 本实验共收集疑似艰难梭菌感染腹泻粪便标本 70例, 经过培养法分离获得 13 株艰难梭菌, 其中 6例携带毒素基因, 阴性标本 57例 (表3) ;CDAB 检测结果6 例为阳性, 3例灰区, 61例为阴性 (表4) ;70 例标本中20例GDH为阳性, 50 例阴性 (表3) 。根据荧光定量 PCR检测结果, tpi基因阳性标本共计 17例 (表 3) , 其中毒素基因 tcd A/tcd B双阳性7例 (表4) 。 表3 GDH及q-PCR检测 tpi与培养法结果的比较 Tab.3 Comparison of GDH and q-PCR detection for tpi with culture method 下载原表 2.2 联合检测与参考标准检测结果 q-PCR (tpi) 联合CDAB与GDH联合CDAB分别将产毒株培养作为检测标准进行比 较, 至少一种方法检测为阳性认为结果判断为阳性 (表5) 。 表4 CDAB, q-PCR检测 tcd A/tcd B与产毒株培养结果的比较 Tab.4 Comparison of CDAB and q-PCR detection for tcd A/tcd B with culture of toxin-producing strains 下载原表 表5 q-PCR与GDH联合 CDAB检测结果与产毒株培养比较 Tab.5 Comparison of q-PCR and detection of both GDH and CDAB with culture of the toxin-producing strains 下载原表 2.3 各个实验室方法单独及联合检测的诊断学指标 以表3~5 的数据计算各检测方法的灵敏度, 特异度, 阳性预测值, 阴性预测值 及诊断符合率, 各诊断指标最优并有统计学意义的加粗下划线标注 (表6、7) 。 表6 各实验室方法单独及联合检测的诊断学指标Tab.6 Diagnostic efficacy of the laboratory methods alone and in combination 下载原表 表7 q-PCR与GDH和 CDAB检测数据及统计学分析 Tab.7 Statistical analysis of the results q-PCR, GDH and CDAB detection 下载原表 2.4 粪便培养产毒艰难梭菌 2.4.1 粪便培养 艰难梭菌在哥伦比亚血平板上面呈灰白色, 边缘不规则菌落, 随着暴露于空气 中的时间增加, 菌落颜色变得更灰, 边缘深染 (图1A) 。在显色平板上, 艰难 梭菌为黑色有光泽菌落, 边缘不整齐 (图1B) 。 2.4.2 产毒株鉴定 艰难梭菌特异性基因 tpi能辅助质谱确证分离的菌株为艰难梭菌, tcd A/B 是艰 难梭菌的毒素编码基因, 提取13株MALDI-TOF MS鉴定为艰难梭菌的 DNA, PCR 扩增tpi 和tcd A/tcd B (图2) 。13株均含有 tpi基因, 确为艰难梭菌, 6株 产毒株中有5株为 AB型菌株, 1株为AB型, 其余均为不产毒菌株。 3 讨论 艰难梭菌感染 (CDI) 被认为是引起抗生素相关性腹泻的主要原因。尽管各级卫 生防疫部门实行了一系列预防感染和降低细菌传播的措施, 但艰难梭菌的感染 率仍居高不下[11-13]。目前CDI的准确诊断是临床预防和治疗所面对的问题之 一。 图1 艰难梭菌在血平板上及显色平板上的菌落形态Fig.1 Colony morphology of CD on blood plate (A) and chromogenic plate (B) . 下载原图 图2 艰难梭菌tpi及毒素基因 (tcd A/tcd B) 扩增电泳图Fig.2 Amplification and electrophoresis of CD tpi and toxin gene (tcd A/tcd B) .M:DL2000 DNA Marker N:Negative control, H2O;P:Positive control, Clostridium difficile strain ATCC-BAA-2155. 下载原图 为此, 本研究同时采用哥伦比亚血琼脂平板和艰难梭菌显色平板进行艰难梭菌 的分离培养, 对两种平板上的疑似菌落均采用 MALDI-TOF MS进行准确鉴定作为 判断其他方法的参考标准。在本研究收集的 70例粪便标本中, 我们以培养法鉴 定艰难梭菌13株, 包括6株产毒株和7株非产毒株, 分离率达到18.57%。参考 国内同类研究, 2008 年上海华山医院[14]从 587份住院病人的粪便标本中检出 56份艰难梭菌阳性的标本, 分离率为9.4%;2009 年北京的程颖等[14]从112份 腹泻标本中检测出 12株艰难梭菌, 阳性率为 10.7%;2013年广州医学院[16]从 467例腹泻患者粪便标本中分离到艰难梭菌 29例, 阳性检出率6.2%;本课题组 2014年至 2015年在本院收集成人腹泻标本 675份, 培养出艰难梭菌 57株, 分 离率为8.44%[17]。以上研究仅使用了常规血平板培养法, 而本研究在联合血平 板及显色平板后, 以及 MALDI-TOF MS的使用, 使菌株分离率显著提高。 目前艰难梭菌感染检测最常见的方法是酶联荧光分析检测细菌毒素 CDAB。本研 究中粪便样本的CDAB 检出率为 8.57% (6/70) , 与国内同类研究的毒素检出率 8.70% (8/92) [18]较为一致, 显著低于国外报道的 15.86% (88/555) [19]。另 3例灰区标本需结合临床判断是否为艰难梭菌感染。6例阳性标本中有 1例经培 养未得到艰难梭菌, 但分离出气荚膜梭菌。据文献报道, 产气荚膜梭菌毒素 Tpe L的氨基酸序列与艰难梭菌毒素 A (Tcd A) 和B (Tcd B) 具有30%~39%的同源性, 且艰难梭菌和产气荚膜梭菌在肠道疾病中可能具有协同作用[20], 因此我们将 该粪便标本采用哥伦比亚血平板和艰难梭菌显色平板再次培养, 依然仅获得产 气荚膜梭菌。将获得的产气荚膜梭菌菌株培养 48 h后检测细菌CDAB, 测试值为 0.27, 判断为灰区。因此我们认为产气荚膜梭菌可能造成 CDAB检测的假阳性结 果。 另外由于样本的保存与运送条件不当等容易造成蛋白降解或抗原变异, 也可 能造成检出率的偏差。 与此同时, 谷氨酸脱氢酶是艰难梭菌表面大量存在的保守抗原, 其稳定性和灵 敏度较高, 最大优势在于有很高的阴性预测值, 通过Meta分析发现, GDH检测 的阴性预测值在94.6%~100%[20]。本实验中 GDH检测灵敏度和特异度分别为 84.62%和 84.21%, 阴性预测值 96.00%, 与现有研究较为一致[23-24]。 最后, 本实验采用q-PCR方法同步扩增艰难梭菌特异性基因tpi、 毒素基因tcd A 和tcd B, 其中tpi 阳性标本17例, 毒素基因阳性 7例, 产毒型艰难梭菌阳性 率为10%。本实验中扩增特异性基因 tpi和毒素基因 tcd A/tcd B与标准方法比 较一致性分别达到91.43%和92.86%, tpi检测的阴性预测值 (98.11%) 高于GDH (96.00%) 检测, 扩增毒素基因 tcd A/tcd B 的诊断价值显著优于CDAB。上海交 通大学医学院附属瑞金医院 2014年报道采用 Xpert Clostridium difficile 检 测试剂盒检测艰难梭菌毒素基因 tcd B, 与培养法相比较敏感性、特异性、阳性 预测值和阴性预测值分别为 87.2%、92.2%、81.0%和94.9%, 与该研究相比, 二 者在特异度上差异并不大, q-PCR的高特异性得以论证。我们同时扩增毒素基因 tcd A和 tcd B, 可以用于筛查临床少见但不能忽略的 AB型菌株[1]。艰难梭菌 特异性基因tpi也有助于筛选携带非产毒艰难梭菌的标本, 进行分离培养后可 用于后续的科学研究。Etienne-Mesmin等[25]在研究小鼠艰难梭菌定殖与发病 时发现q-PCR检测到的粪便中毒素基因水平与细胞毒性实验检测到的粪便毒素 水平是相关的。综合二者, 开展q-PCR方法检测艰难梭菌特异性基因 tpi、毒素 基因可满足临床快速准确诊断的需要。在本研究中, q-PCR方法仍然具有一定的 假阳性出现, 我们将进一步加大样本量进行验证, 以及寻求特异性更高的引物 序列方案。 我们还通过回顾性查阅病例发现:所有艰难梭菌培养阳性患者住院期间均长期使 用质子泵抑制剂联合亚胺培南和替加环素等抗生素。 大量研究也证实 CDI发病与 患者年龄 (≥65岁) 、住院时间、炎性反应肠病、使用免疫抑制剂、质子泵抑 制剂及广谱抗生素等多种危险因素密切相关[26-27]。因此对具备以上诱发 CDI 因素的患者应加强对 CDI的监测。 对于疑似 CDI患者, 可利用qPCR法进行初筛。 在满足临床快速诊断的前提下, 可结合艰难梭菌显色平板的菌培养进行确诊。 总之, 与其他检测方法相比, q-PCR检测粪便标本中的艰难梭菌具有时效性强、 灵敏度高、特异性好等优点, 适用于临床推广。 参考文献 [1]Chen LD, Li LH, Liao Y, et al.Molecular characterization and antimicrobial susceptibility of tcd A-negative Clostridium difficile isolates from Guangzhou, China[J].Diagn Microbiol Infect Dis, 2016, 84 (4) :361-5. 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