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多环芳烃菲和荧蒽半抗原的制备及量化计算.doc

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多环芳烃菲和荧蒽半抗原的制备及量化计算 刘媛媛 陈奇娜 潘学春 黄江春 李壹 东南大学成贤学院制药与化学工程学院 南京工业大学食品与轻工学院 摘 要: 以多环芳烃菲和荧蒽为原料, 分别与丁二酸酐发生傅克酰基化反应, 制备 γ-羰基-2-菲丁酸和 γ-羰基-3-荧蒽丁酸, 再经黄鸣龙还原制备半抗原 2-菲丁酸和 3-荧蒽丁酸, 产品结构经熔点、IR 和 1HNMR 表征。采用量子化学计算优化两种半抗原的分子构型, 获得前线轨道、能量、电子分布及稳定性等信息, 辅助半抗原的设计和筛选, 为制备高特异性人工抗原奠定了基础。关键词: 菲丁酸; 荧蒽丁酸; 傅克酰基化反应; 黄鸣龙还原; 量子化学计算; 作者简介:刘媛媛 (1985-) , 女, 江苏南京人, 博士, 副教授, 主要从事药物分子设计、合成及生物活性研究。作者简介:李壹, E-mail:liynj2012@njtech.edu.cn。收稿日期:2017-03-26基金:江苏省自然科学基金青年基金资助项目 (BK-20130749) Preparation and Quantum Chemical Calculation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Nanthrene and Fluoranthene HaptensLIU Yuan-yuan CHEN Qi-na PAN Xue-chun HUANG Jiang-chun LI Yi Department of Chemical and Pharmaceutical Engineering, Southeast University Chengxian College; College of Food Science and Light Industry, Nanjing Technology University; Abstract: Using polycyclic aromatic hydrocarbons phenanthrene and fluoranthene as starting materials, 4-oxo-4- ( phenanthren-2-yl) butanoic acid and 4- ( fluoranthen-3-yl) -4-oxobutanoic acid were synthesized by the Friedel-Crafts acylation with dihydrofuran-2, 5-dione, respectively. Then haptens 4- ( phenanthren-2-yl) butanoic acid and 4- ( fluoranthen-3-yl) butanoic acid were prepared via Huang Min-lon reduction. The structures were confirmed by melting point, IR and1 HNMR. The molecular configurations of haptens were optimized by quantum chemical calculation, and the frontier orbital energy, electronic distribution and stability were obtained.These parameters can assist the design and screening of hapten, and lay the foundation for the preparation of high specific antigen.Keyword: 4-oxo-4- (phenanthren-2-yl) butanoic acid; 4- (fluoranthen-3-yl) -4-oxobutanoic acid; Friedel-Crafts acylation; Huang Min-lon reduction; quantum chemical calculation; Received: 2017-03-26多环芳烃 (PAHs) 是由两个及以上芳香环组成的有机化合物, 虽然在环境中微量存在, 但其具有致癌性, 通过呼吸道、皮肤等进入人体, 极大地威胁人类健康。目前, PAHs 的检测主要是高效液相色谱法 (HPLC) 和气相色谱法 (GC) [1,2], 但其样品前处理繁琐 (如液液萃取 (LLE) [3]、固相萃取 (SPE) [4]和超临界流体萃取 (SFE) [5]) 。免疫分析法是近年来兴起的、以特异性抗原-抗体反应为基础的分析方法[6-8], 与 HPLC 法和 GC 法相比, 具有以下优点:1) 无需或只需很少的样品前处理, 可以实现快速检测;2) 能同时分析多个样品, 且只需小量样品 (L) , 可进行筛查分析;3) 不需要昂贵的大型仪器, 成本低、使用方便可靠, 便于现场监测分析。然而, PAHs 属于小分子化合物, 无法直接诱导动物机体产生特异性抗体, 其分子本身也没有供偶联的活性基团 (如氨基、羧基等) , 因此也不能与载体蛋白偶联形成抗原。若对 PAHs 进行修饰衍生化, 接上活性基团使其能与载体蛋白偶联, 则有可能形成能产生特异性抗体的抗原, 这种经人工修饰后的抗原称为人工抗原, 而衍生化产物则称为半抗原。半抗原设计的关键在于尽可能保留原待测物的特征结构, 并在适当的位置引入合适的连接臂和能与载体蛋白偶联的活性基团。本文在前期报道的萘半抗原及人工抗原制备的基础上[9], 以 PAHs 菲和荧蒽为原料, 分别与丁二酸酐发生傅克酰基化反应, 制备 γ-羰基-2-菲丁酸 (1) 和γ-羰基-3-荧蒽丁酸 (3) 。再经黄鸣龙还原制备半抗原 2-菲丁酸 (2) 和 3-荧蒽丁酸 (4) 。采用量子化学计算优化半抗原 2 和 4 的分子构型, 获得前线轨道、能量、电子分布及稳定性等信息, 辅助半抗原的设计和筛选, 为制备高特异性人工抗原奠定了基础, 具体合成路线如下所示。多环芳烃半抗原 2 和 4 的合成路线 Synthesis route of PAHs haptens 2 and 4 下载原图1 实验部分1.1 主要仪器与试剂RE-2000 型旋转蒸发仪 (杭州大卫科教仪器有限公司) ;ZF-1 型三用紫外分析仪 (上海顾村电光仪器厂) ;X-4 型显微熔点测定仪 (北京泰克仪器有限公司) ;Nicolet-380FT 型红外光谱仪 (美国 Thermo 公司) ;AM-400 型核磁共振波谱仪 (瑞士 Bruker 公司) 。菲、荧蒽、丁二酸酐、二氯甲烷、氢氧化钾 (分析纯, 江苏永华化学有限公司) ;三氯化铝、无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、无水硫酸钠 (分析纯, 国药集团化学试剂有限公司) ;水合肼 (80%, 分析纯, 西陇科学股份有限公司) ;二甘醇、浓盐酸 (分析纯, 上海凌峰化学试剂有限公司) ;柱层析硅胶 (100~200 目, 烟台黄务硅胶开发试验厂) 。1.2 实验方法1.2.1 γ-羰基-2-菲丁酸 (1) 的合成合成方法参照文献[10]。冰浴下 (0℃) , 将 1.78 g (10.0 mmol) 菲和 3.00 g (22.0 mmol) 无水三氯化铝溶解在 10 m L 二氯甲烷中, 搅拌下缓慢滴加 10 m L 含 1.00 g (10.0 mmol) 丁二酸酐的二氯甲烷溶液, 约 30 min 滴完, 反应液变为棕褐色, 冰浴反应 2 d, 得墨绿色溶液。倒入碎冰中, 有亮黄色固体生成, 加入 50 m L (1 mol/L) 冰盐酸加热 20 min 使其溶解, 得淡黄色溶液。分层, 有机层加入 10%Na OH 溶液加热反应 10 min, 得红褐色溶液, 分层, 水层加稀盐酸酸化得粉褐色沉淀, 过滤, 用乙醇重结晶得 1.81 g 粉色晶体, 收率为 65%, m.p.205~206℃。IR (KBr) , ν, cm:3 058 (ν CH ) ;3 000~2 500 (缔合羟基ν —OH) ;2 920 (ν C—H) ;1 708, 1 679 (ν CO ) ;1 605, 1 518, 1 463 (苯环骨架 ν CC ) ;1 245 (ν C—O) ;843, 747 (γ CH ) 。HNMR (DMSO-d 6, 400 MHz) , δ:9.40 (s, 1H, Ar—H) ;8.98 (d, 1H, J=8.2 Hz, Ar—H) ;8.17~7.70 (m, 7H, Ar—H) ;2.67 (t, 2H, J=6.2 Hz, CH2) ;2.51 (t, 2H, J=6.2 Hz, CH2) 。1.2.2 2-菲丁酸 (2) 的合成在 100 m L 四口烧瓶中依次加入 1.39 g (5.00mmol) 化合物 1、2.50 g (0.045 0 mol) 氢氧化钾、2.5 m L (80%) 水合肼和 50 m L 二甘醇, 机械搅拌, 回流反应 3 h, 接分水器, 蒸除反应体系中过量的水合肼和水。拆走分水器, 升温至 200℃左右, 回流反应 3 h。冷却, 倒入冰水中, 加浓盐酸调至 p H 2, 乙酸乙酯萃取 (20 m L×3) , 无水硫酸钠干燥, 过滤, 旋蒸除去溶剂, 残余物经柱层析 (V (乙酸乙酯) ∶V (石油醚) =1∶3) 分离提纯得 0.793 g 黄色固体, 收率为 60%, m.p.133~134℃。IR (KBr) , ν, cm:3 044 (ν CH ) ;3 000~2 500 (缔合羟基 ν —OH) ;2 928 (ν C—H) ;1 692 (ν CO ) ;1 603, 1 513, 1 433 (苯环骨架 ν CC ) ;1 278 (ν C—O) ;840, 744 (γ CH ) 。HNMR (CDCl 3, 400 MHz) , δ:8.65~8.53 (m, 1H, Ar—H) ;8.41 (s, 1H, Ar—H) ;7.81~7.36 (m, 7H, Ar—H) ;2.88 (t, 2H, J=7.6Hz, CH2) ;2.38 (t, 2H, J=7.6 Hz, CH2) ;2.08~2.01 (m, 2H, CH2) 。CNMR (CDCl 3, 100 MHz) , δ:179.7, 139.6, 132.2, 130.5, 130.4, 130.1, 128.7, 128.6, 127.5, 126.7, 126.6, 126.5, 126.3, 122.7, 122.1, 35.6, 33.4, 26.5。1.2.3 γ-羰基-3-荧蒽丁酸 (3) 的合成合成方法参照文献[11]。冰浴下 (0℃) , 将 2.02 g (10.0 mmol) 荧蒽和 3.00 g (22.0 mmol) 无水三氯化铝溶解在 20 m L 硝基苯中, 搅拌下缓慢滴加 10 m L 含 1.00 g (10.0 mmol) 丁二酸酐的硝基苯溶液, 约 30 min 滴完, 反应液变为棕褐色, 冰浴反应 12 h, 加稀盐酸终止反应。倒入烧杯中, 分离出的有机层用大量稀盐酸水洗后, 旋蒸除去硝基苯, 得黄色固体粉末, 用甲醇-乙醚重结晶得 1.75 g 黄色晶体, 收率为 58%, m.p.198~199℃。IR (KBr) , ν, cm:3 045 ( ν CH) ;3 000~2 500 (缔合羟基 ν —OH) ;2 923 (ν C—H) ;1 706, 1 676 (ν CO ) ;1 607, 1 483 (苯环骨架 ν CC ) ;1 257 (ν C—O) ;813, 775 ( γ CH) 。HNMR (CDCl 3, 400 MHz) , δ:8.18~7.42 (m, 9H, Ar—H) ;3.40 (t, 2H, J=7.2Hz, CH2) ;1.14 (t, 2H, J=7.2 Hz, CH2) 。1.2.4 3-荧蒽丁酸 (4) 的合成合成方法参照 1.2.2 中化合物 2 的合成方法, 经柱层析 (V (乙酸乙酯) ∶V (石油醚) =1∶3) 分离提纯得 0.793 g 淡黄色固体, 收率为 55%, m.p.140~141℃。IR (KBr) , ν, cm:3 041 (ν CH ) ;3 000~2 500 (缔合羟基ν —OH) ;2 947 (ν C—H) ;1 695 (ν CO ) ;1 603, 1 507, 1 455 (苯环骨架ν CC ) ;1 274 (ν C—O) ;814, 771 (γ CH ) 。HNMR (CDCl 3, 400 MHz) , δ:7.86~7.66 (m, 9H, Ar—H) ;2.73 (t, 2H, J=7.6 Hz, CH 2) ;2.36 (t, 2H, J=7.6 Hz, CH2) ;2.09~1.97 (m, 2H, CH2) 。CNMR (CDCl 3, 100 MHz) , δ:179.9, 140.9, 139.9, 137.6, 137.0, 132.7, 130.0, 127.9, 126.7, 126.3, 121.8, 121.5, 120.0, 119.8, 35.4, 33.4, 26.4。1.2.5 量子化学计算采用量子化学密度泛函理论 (DFT) (Gaussian 09 软件, B3LYP/6-31G**基组) 计算法[12,13], 对半抗原化合物 2 和化合物 4 的最低能量构型进行全优化。优化得到的.fchk 文件使用 Guass View 5.0 软件, 计算前线分子轨道、HOMO 和LUMO 值、电子云密度分布等特性参数。2 结果与讨论2.1 红外光谱分析2.2 傅克反应的溶剂选择常用作傅克反应的溶剂可分为以下 3 类:1) 非极性溶剂, 如二硫化碳、四氯化碳、苯 (有活泼芳环存在时, 苯不参加反应) , 这类溶剂既不溶解催化剂氯化铝, 也不溶解氯化铝和酰化试剂的配合物, 反应为非均相;2) 极性溶剂, 如硝基苯, 能溶解氯化铝和配合物, 反应为均相;3) 中性溶剂, 如二氯甲烷、1, 2-二氯乙烷, 不能溶解氯化铝, 但能溶解配合物, 反应开始为非均相, 后逐渐转为均相。本文选用了两种常用于傅克反应的有机溶剂二氯甲烷和硝基苯制备化合物 1 和化合物 3。傅克反应需在低温下进行, 温度升高, 副反应增加, 收率降低。当选择硝基苯作溶剂时, 均可制备化合物 1 和化合物 3;当选用二氯甲烷作溶剂时, 化合物 1 的收率略有升高, 但没能得到化合物 3, 因为荧蒽在二氯甲烷中几乎不溶, 傅克反应无法发生, 而二氯甲烷沸点低, 与高沸点的硝基苯相比, 降低了后处理的难度。因此, 化合物 1 和化合物 3 的制备, 分别选用二氯甲烷和硝基苯作溶剂。2.3 量子化学计算2.3.1 优化分子结构基于密度泛函理论 (DFT) 中的 B3LYP/6-31G**基组对菲、荧蒽、半抗原化合物2 和 4 的分子结构进行优化, 优化结构如下所示。菲、荧蒽、半抗原化合物 2 和 4 的优化结构 Optimized structure of phenanthrene, fluoranthene, hapten 2 and 4 下载原图2.3.2 前线轨道和能量化合物的前线轨道能量在生物活性中占有重要作用[14]。分子最高占据轨道的能量 (E HOMO) 表示化合物给出电子的能力。通常 EHOMO越大, 化合物的生物活性越强。而分子最低空轨道的能量 (E LUMO) 恰好相反。从菲、荧蒽、半抗原化合物 2 和 4 的分子前线轨道图和能量差 (表 1) 可以发现, 半抗原化合物 2 和 4的 EHOMO和 ELUMO的能量差 ΔE 分别小于菲和荧蒽的 ΔE, 说明半抗原化合物 2 和4 更活泼, 更容易与蛋白质偶联生成抗原;而其电子云主要集中在菲环和荧蒽环, 说明这些部分是最有可能被抗体识别的抗原部位。表 1 菲、荧蒽、半抗原化合物 2 和 4 的能量差 Tab.1 Energy gap of phenanthrene, fluoranthene, hapten 2 and 4 下载原表 菲、荧蒽、半抗原化合物 2 和 4 的分子前线轨道图 HOMO and LUMO of phenanthrene, fluoranthene, hapten 2 and 42.3.3 静态电势图从静态电势图可知, 哪些区域是富电子区, 哪些区域是缺电子区, 哪些原子易被亲核试剂攻击, 哪些原子易被亲电试剂攻击。菲、荧蒽、半抗原化合物 2 和4 的静态电势图如右上所示。从图中可以看出, 半抗原化合物 2 和 4 的菲环和荧蒽环所在的相应区域, 正电势均匀地分布在环的边缘, 负电势均匀地分布在环平面的上下两侧。与原料菲和荧蒽相比, 虽然半抗原化合物 2 和 4 的衍生基团 (羧基) 属吸电子基团, 但菲环和荧蒽环相应区域的静电势没有发生明显变化, 说明其保留了菲环和荧蒽环原有的静态电势分布。此外, 半抗原化合物 2和 4 的羰基氧原子上负电荷最大, 而正电荷主要分布在羧基 H 周围。菲、荧蒽、半抗原化合物 2 和 4 的静态电势图 Electrostatic potential isosurface of phenanthrene, fluoranthene, hapten 2 and 4 下载原图3 结论本文以多环芳烃菲和荧蒽为原料, 分别与丁二酸酐发生傅克酰基化反应, 再经黄鸣龙还原制备半抗原 2-菲丁酸 (2) 和 3-荧蒽丁酸 (4) , 并采用量子化学计算优化分子构型, 获得前线轨道、能量、电子分布及稳定性等信息。结果表明, 半抗原化合物 2 和 4 的 EHOMO和 ELUMO的能量差 ΔE 分别小于菲和荧蒽的 ΔE, 说明半抗原化合物 2 和 4 更活泼, 更容易与蛋白质偶联生成抗原。虽然半抗原 2和 4 的衍生基团 (羧基) 属吸电子基团, 但菲环和荧蒽环所在的相应区域的静电势没有发生明显变化, 说明其保留了菲环和荧蒽环原有的静态电势分布。这些参数有助于半抗原的设计和筛选, 为制备高特异性人工抗原奠定了基础。参考文献[1]POSTER D L, SCHANTZ M M, SANDER L C, et al.Analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in environmental samples:a critical review of gas chromatographic (GC) methods[J].Anal.Bioanal.Chem., 2006, 386 (4) :859-881. 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