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2012年-2016年青岛地区串联质谱检测结果分析.doc

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2012年-2016 年青岛地区串联质谱检测 结果分析 宋东坡 李文杰 吕金峰 王彩娟 青岛市妇女儿童医院新筛实验室 摘 要: 目的 对2012年-2016年青岛地区串联质谱检测情况进行总结分析。 方法 对2012 年1月-2016年12 月青岛地区出生的新生儿足跟血进行氨基酸代谢异常、有机 酸代谢异常、脂肪酸代谢异常等 26种遗传代谢病串联质谱检测, 总结目前青岛 地区新生儿串联质谱筛查工作现状, 分析筛查情况的逐年变化, 比较青岛地区 与国内外其他地区遗传代谢病发病率及种类分布, 同时分析临床样本遗传代谢 病的发病情况。结果 青岛地区 2012年串联质谱筛查 5 904例, 确诊 1例;2016 年串联质谱筛查115 791例, 确诊58例, 疾病种类为15种, 其中以高苯丙氨酸 血症和甲基丙二酸血症为主;临床可疑阳性遗传代谢病样本呈下降趋势, 2016年 临床样本中确诊3例遗传代谢病患者。结论 青岛地区随着串联质谱筛查量的增 加, 遗传代谢病确诊人数和疾病种类不断增加, 及时的诊疗避免了临床损害。 因 此, 新生儿遗传代谢病串联质谱筛查非常必要, 是三级预防的重要手段, 对于 提高人口质量意义重大。 关键词: 青岛; 串联质谱; 出生缺陷; 新生儿疾病筛查; 遗传代谢病; 作者简介:李文杰, E-mail:wenjie6656@126.com 我国新生儿出生缺陷呈逐年上升的趋势, 目前主要针对先天性心脏病、唇腭裂、 神经管缺陷、 脑积水、 肢体缩短、 耳外畸形、 隐睾等器质性出生缺陷研究报道[1]。 但是对新生儿遗传代谢性病方面总结研究较少, 使得一些新生儿或婴幼儿体格 和智力发育落后, 甚至出现惊厥、昏迷、脑瘫、猝死等重大疾病发生, 严重影响 患者生命质量。 新生儿遗传代谢病的筛查有利于出生缺陷的早期诊断并治疗, 提 高出生人口素质。本研究总结 2012年-2016 年青岛地区新生儿串联质谱检测工 作的开展情况, 分析青岛地区各种罕见遗传代谢病的发病率及种类并与国内外 进行对比。现将结果报道如下。 1 资料与方法 1.1 资料来源 回顾性分析青岛市南区、市北区、李沧区、崂山区、城阳、即墨、莱西、平度、 胶州、黄岛、开发区 2012年-2016年参加串联质谱筛查的 158 868 例新生儿和 366例门诊及住院患儿的相关信息。排除采血不合格标本, 不排除早产儿, 体质 量儿, 不排除籍贯为青岛市外的新生儿。 1.2 方法 采血:采集出生满72 h并6次饱奶新生儿足跟血, 滴在滤纸片上, 晾干后冷藏运 送至青岛新筛实验室, 门诊及住院患儿近日无输血和抗生素的使用, 3 个月龄以 上的患儿可采指尖血。样本处理: (1) 使用自动打孔仪打孔, 取直径为 3mm干血 斑至96 孔萃取板内 (A1~A6为空白、两低质控、两高质控、空白) ; (2) 取出 内标储备液, 室温放置 2 min; (3) 配制工作液:肉碱:氨基酸:萃取液按 1∶1∶108的比例配置, 混匀2 min; (4) 每孔加100μl工作液, 黏性封膜封上, 做好标记; (5) 将萃取板放入已预热的振荡孵育器中, 45℃, 650 r/min, 孵育 45 min; (6) 将板取出, 转移75μl至V型底96孔板对应孔中, 封上铝箔膜, 做 好标记, 上机检测。 1.3 仪器设备 (1) Punch9自动打孔仪; (2) HPLC泵 (Waters 1525u Binary) ; (3) Waters 进样器 (2777C) ; (4) 串联质谱仪 (Waters Quattro micro API;TQ detector) ; (5) Thermo scientific振荡孵育器 (i EMS) (6) U型底洁净96孔微孔板 (NUNC) , V型耐热96孔微孔板 (NUNC) ; (7) Eppendorf Research plus 移液器 (20μl, 100μl, 200μl, 1 000μl) ;Eppendorf Research 移液器 (300μl) 。 1.4 结果处理 串联质谱是根据质谱峰的质荷比值 (m/z) 进行定性, 质谱峰强度与它代表的化 合物的含量成正比, 测定目标分子离子峰的强度, 通过与已知浓度的相应内标 离子峰强度比可进行定量分析。定量分析是由计算机软件 (Masslynx V4.0/4.1 Waters) 完成。串联质谱检测指标共 76项, 可以筛查26种遗传代谢病。指标轻 度异常进行召回复查;指标严重异常或复查结果异常进行召回确诊。召回确诊的 患儿均进行基因诊断、必要时进行一代测序验证、父母验证以及尿有机酸分析、 尿氨基酸分析、酶活性测定及肝功、血氨、血糖、同型半胱氨酸等相关指标的检 测, 同时结合临床表现, 进行诊断。阳性患儿给予及时必要的治疗。 2 结果 2012年青岛市新筛实验室率先开展了新生儿串联质谱检测, 标本来源局限于青 岛市妇女儿童医院出生的新生儿, 至2015年8月该项目扩大到整个青岛市地区, 筛查人数增幅明显。2012年筛查5 904例, 2016 年筛查人数达到了 115 791例。 见表1。串联质谱筛查率由 2012年的6.00%上升到2016年的78.98%。随着筛查 率的上升, 可疑阳性患儿, 确诊阳性患儿数量逐年增加, 并不断出现新的阳性 疾病病种。 2012年阳性患儿1例, 2013年2例, 2014年4例, 2015年12例, 2016年58例。 遗传代谢种由1种增加到15种。 其中最为常见的是高苯丙氨酸血症 (24 例) 和甲基丙二酸血症 (21例) , 其余为原发肉碱缺乏 (6例) 、母源性肉碱缺 乏 (6 例) 、瓜氨酸血症/希特林蛋白缺乏 (5 例) 、短链酰基辅酶A 羟化酶缺乏 (3例) 、3-甲基-巴豆酰基辅酶 A脱氢酶缺乏 (2例) 、中链酰基辅酶 A脱氢酶 缺乏 (2 例) 、极长链酰基辅酶 A脱氢酶缺乏 (2例) 、精氨酸琥珀酸尿症 (1 例) 、 同型半胱氨酸血症 (1例) 、 戊二酸血症Ⅱ型 (1例) 、 枫糖尿症 (1例) 、 丙酸血症 (1例) 、高甲硫氨酸血症 (1例) 。将2014-2016年的临床样本的串 联质谱检测结果进行整理分析, 结果表明, 2014-2016年共检测临床样本 366例, 可疑阳性53例, 确诊 16例。 阳性临床样本中, 甲基丙二酸血症者居多 (7例) , 其次是瓜氨酸血症 (3例) 和枫糖尿症 (2例) , 高苯丙氨酸血症、原发肉碱缺 乏、 丙酸血症、 高甲硫氨酸血症各 1例。 所有的阳性确诊标本均进行了基因诊断, 基因结果与诊断相符 87例, 基因结果与确诊不符但临床诊断阳性 6 例。 表1 2012 年-2016 年青岛新筛中心筛查情况及临床样本检测结果 下载原 表 3 讨论 3.1 串联质谱筛查的国内外现状及意义 串联质谱技术最早于 1990年在美国北卡罗莱州用于新生儿代谢异常的筛查, 直 至2003 年我国上海率先开展该项技术应用于新生儿和临床危重患儿的遗传代谢 病检测, 目前该技术在许多国家已经普及[2]。串联质谱技术通过检测样品中物 质的质荷比 (相对分子质量) , 对物质进行定性和定量分析, 可同时检测1滴血 中70余种氨基酸和酰基肉碱, 结合相关指标间的比值对多种氨基酸、有机酸和 脂肪酸氧化代谢病进行快速的筛查和诊断。串联质谱对高苯丙氨酸血症、枫糖尿 病、瓜氨酸血症、酪氨酸血症和精氨酸血症的检测具有特异性。因此该技术用于 新生儿疾病筛查使得很多罕见的遗传代谢病被提前发现, 避免了严重的临床损 害。 青岛新生儿疾病筛查实验室自 2012年开展了串联质谱 26种遗传代谢病筛查。 目 前, 各区集中一周的样本冷藏专人递送至筛查实验室。串联质谱共检测 76种指 标、26种疾病, 比美国代谢性疾病筛查[3]缺少琥珀酰丙酮这一指标, 因此不能 鉴别酪氨酸血症I型和希特林蛋白缺乏症、半乳糖血症。检测结果由临床医生和 实验室技术人员联合判读, 指标轻度异常定为召回复查, 严重异常及召回标本 仍异常者定为召回确诊, 召回确诊的标本进行基因、 尿氨基酸和/或有机酸检测, 同时进行血氨、肝功及其他必要的生化检测辅助诊断。阳性患者一旦诊断立即进 行必要的治疗, 特别是临床危重患儿的诊断治疗周期可以缩短至 1天, 抢占治 疗先机, 这比Maria 等[4]针对 PKU诊断治疗周期的报道有了明显的提高。目前 实验室存在与韩国[5]相似的较高的复查率, 初筛阳性预测值较低的问题。虽然 韩国研究者试图开展基因筛查来解决这一问题, 但考虑成本及先天性甲低等非基因病而受到限制, 目前也使用召确和基因测序及其他生化指标综合判断流程。 针对存在的问题实验室将通过采用更大数据的统计结果进行检测指标截断值的 调整以及开展尿GC-MS检测和相关酶活性检测等其他辅助检查来提高诊断的准 确性和特异性。另外, 加拿大的遗传代谢病研究中心[6]认为自身存在对中链酰 基辅酶A缺乏症过高的假阳性诊断, 目前实验室只诊断了2例该病, 均进行了基 因诊断及父母验证, 不存在假阳性的问题。 目前, 很多筛查中心均存在阳性预测 值较低的问题, 如何提高诊断的特异性和准确性是需要研究的方向。 3.2 筛查结果 查阅了国内外近十年的文献, 发现报道较多的是对单一疾病的诊断及治疗随访 包括原发性肉碱缺乏症[7]、 异戊酸血症[8]、 戊二酸血症[9]、 尿素循环障碍[10]、 甲基丙二酸血症[11]、枫糖尿症[12]、多种羧化酶缺乏症[13]等, 对筛查地区筛 查结果的总结分析报告很少。2015年李旺[14]报告了广西新生儿串联质谱筛查 阳性发生率为1/10 165, 其中游离肉碱缺乏8例;瓜氨酸血症4例;PUK 3例;2011 年黄新文[15]报告了杭州地区新生儿进行了串联质谱筛查阳性发生率为 1/5 626, 其中高苯丙氨酸血症 7例;原发性肉碱吸收障碍 4例;甲基丙二酸血症 2例。 本文 动态分析了青岛筛查实验室 2012-2016年串联质谱筛查情况。 在加强串联质谱筛 查必要性的宣传工作之后筛查量由2012年5 904例上升为2016年115 791例, 筛 查率由2012年6.00%上升为2016年78.98%。 随着筛查人数的增加, 可疑阳性人 数, 确诊人数不断增加, 疾病种类也出现了激增。发病率由 1/5 904 上升到1/1 996, 总体发病率为 1/2 063, 明显高于黄新文和李旺的报告结果;疾病种类也由 原来的1种变为现在 15种, 涉及了脂肪酸、氨基酸、有机酸三大种类代谢异常, 其中高苯丙氨酸血症 24例最为常见, 占所有阳性标本 31.17%, 经典型 21例, BH4型 3 例。其次为甲基丙二酸血症 21例, 占所有阳性标本27.28%。合并同型 半胱氨酸血症20例, MUT型1例。另外原发性肉碱缺乏和母源性肉碱缺乏各 6 例以及瓜氨酸血症 5例相对常见。从广西、杭州和青岛的筛查结果分析可见遗传 代谢病总体发病率北方高于南方, 且种类分布差别明显。美国 2001-2010年51 个州新生儿筛查结果显示[16], 其整体发病率排在前 5名的分别是高苯丙氨酸 血症、中链酰基辅酶 A脱氢酶缺乏、3-甲基巴豆酰基辅酶 A羧化酶缺乏、半乳糖 转移酶缺乏和极长链酰基辅酶 A脱氢酶缺乏。 比较截至目前国内的数据, 由于地 域和种族的差异我国各地区遗传代谢病的发病率高低不同, 疾病种类分布不一, 总体数据有待健全网络功能后完善。 3.3 临床检测结果分析 实验室检测了2014-2016年的临床标本366 例, 确诊遗传代谢病16 例, 以甲基 丙二酸血症为主, 瓜氨酸血症和枫糖尿症次之。比较 2013年韩凤等[17]公布的 数据, 来自全国200余所家医院, 9 046例临床遗传性代谢病疑似患者, 确诊564 例, 占有机酸血症 60%的甲基丙二酸血症最多, 占氨基酸发病37.9%的希特林蛋 白缺乏症最多, 与本分析结果基本相同。 动态分析本中心 2014-2016 年临床标本 检测结果, 发现2014-2015年临床送检331 例, 确诊13例, 以甲基丙二酸血症 为主。2016年临床送检 25例, 确诊3例, 分别是原发肉碱缺乏 1例, 高甲硫氨 酸血症1例, 瓜氨酸血症 1例。其中原发肉碱 1例来自筛查UCD患者之母;高甲 硫氨酸1例在其他地区筛查可疑, 本实验室确诊;瓜氨酸血症1例初筛正常, 后患儿表现持续黄疸, 临床就诊后确诊。 结合筛查结果, 最为常见的甲基丙二酸血 症在大面积筛查后, 临床未见发病, 说明串联质谱筛查对甲基丙二血症较为敏 感, 而对于瓜氨酸血症来说敏感性较差, 但是总体来讲通过大面积提高遗传代 谢病的筛查率后临床的阳性患者呈现下降趋势, 结果强调了遗传代谢病串联质 谱筛查的必要性, 通过串联筛查可以有效的避免一些遗传代谢病的临床损害, 提高患者的生命质量。 串联质谱技术在美国、日本、韩国等国家普及, 在我国大部分地区也应用于新生 儿疾病筛查。实验室在 2015年 8月全市普及筛查后, 阳性患者和疾病种类出现 明显增多趋势, 且青岛地区遗传代谢病的发病率远高于美国及国内南方地区, 患病种类也有所不同。青岛地区以苯丙酮尿症及甲基丙二酸血症常见。由于地域 和人种的不同导致遗传代谢病的分布差异, 了解本地区的疾病谱将对新生儿遗 传代谢病的诊断、产前诊断、流行病学调查分析以及提高出生人口质量方面起到 重要作用。 参考文献 [1]刘凤岐, 李晔, 于晓花, 等.我国部分地区近年新生儿出生缺陷概况[J].中 国地方病防治杂志, 2015, 30 (6) :475-477. 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