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EGLN3对口腔鳞状细胞癌患者的临床预后作用.doc

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EGLN3对口腔鳞状细胞癌患者的临床预后作用.doc
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EGLN3对口腔鳞状细胞癌患者的临床预 后作用 徐佳 余周庆 彭治凯 郑杰 恩施土家族苗族自州中心医院口腔诊疗中心 摘 要: 目的:研究 EGLN3基因对口腔鳞状细胞癌患者预后的影响意义。 方法:通过二次分 析口腔鳞状细胞癌基因表达数据集 GSE42743, 明确EGLN3基因在口腔鳞状细胞 癌组织和其相应的正常口腔黏膜组织中的表达差异, 探讨EGLN3 (egl-9 family hypoxia inducible factor 3, egl-9家庭缺氧诱导因子 3) 基因与口腔鳞状细 胞癌患者的年龄、性别、吸烟情况、肿瘤部位、T分期、PN分期 (pathological N分期) 、CN分期 (clinical N分期) 以及 AJCC (American Joint Committee on Cancer, 美国肿瘤研究联合委员会) 分期、 总生存期及口腔鳞状细胞癌特异性总 生存期间的关系, 并运用基因集富集分析方法进一步探讨 EGLN3基因对口腔鳞 状细胞癌细胞的具体作用机制。结果:EGLN3 基因在口腔鳞状细胞癌组织中的表 达显著高于癌旁正常组织 (P<0.0001) , 高表达EGLN3的口腔鳞状细胞癌患者的 T分期、CN分期 (临床分期) 、PN分期 (病理分期) 、AJCC分期方面明显劣于 EGLN3低表达组口腔鳞状细胞癌患者 (P=0.017, P=0.001, P=0.04, 以及 P=0.02) , EGLN3低表达组口腔鳞状细胞癌患者的总生存期与口腔鳞状细胞癌特 异性总生存期均显著优于 EGLN3高表达组口腔鳞状细胞癌患者 (两组 P值均 <0.0001) 。GSEA (gene set enrichment analysis, 基因集富集分析) 分析提 示EGLN3 基因可能通过 m TORC1、 E2 F、 MYC、 NOTCH 信号通路以及PI3 K-AKTm TOR、 蛋白分泌、有丝分裂、细胞周期 G2M检查点, 糖酵解、胆固醇代谢、去折叠蛋白 反应等多种生物学过程作用于口腔鳞状细胞癌细胞。结论:EGLN3基因是口腔鳞 状细胞癌患者的独立预后不良因素。 关键词: 口腔鳞状细胞癌; EGLN3 基因; 临床预后; 作者简介:郑杰, E-mail:nononemo@163.com The clinical significance of EGLN3 in the patients with oral squamous cell carcinoma XU Jia YU Zhou-qing PENG Zhi-kai ZHENG Jie The cental hospital of Enshi autonomous prefecture; Abstract: Objective: To investigate the prognostic role of EGLN3 in patients with oral squamous cell carcinoma.Methods: The oral squamous cell carcinoma ( OSCC) gene expression datasets GSE42743 was reanalyzed to characterize the expression of EGLN3 gene between oral cancer patients and adjacent normal tissue, and the correlations between EGLN3 expression and the T staging, CN staging, PN staging, AJCC staging, overall survival and OSCC specific survival of oral cancer patients. Gene set enrichment analysis was applied to investigate the exact mechanisms regarding the expression of EGLN3 and the proliferation of OSCC cells. Results: The level of EGLN3 expression was significantly higher in OSCC patients than that in normal controls ( P < 0. 0001) . OSCC patients with lower expression of EGLN3 were associated with better T staging, PN staging, CN staging, AJCC staging, overall survival, and OSCC specific survival compared with EGLN3 higher expression cohort. The result of GSEA indicated that EGLN3 might promote the proliferation of OSCC cells biological processes involving m TORC1, E2 F, MYC, and NOTCH signaling, protein secretion, mitotic spindle, G2 M checkpoint, glycolysis, cholesterol homeostasis and unfold protein response. Conclusion: EGLN3 might be an independent risk factor for OSCC patients. Keyword: Oral squamous cell carcinoma; EGLN3; Clinical prognosis; 口腔癌 (oral cancer) 指的是发生于口腔及其毗邻解剖结构恶性肿瘤, 其中约 90%属于鳞状细胞癌 (oral squamous cell carcinoma, OSCC) , 约占全身系统 恶性肿瘤的3%[1]。口腔癌患者的临床预后受多重因素的影响 (如临床病理特征, 手术方式, 放化疗方案、吸烟、饮酒以及是否伴随 HPV病毒感染等) 。虽然近年 来口腔癌患者的临床预后有了较大改善, 但多数患者被确诊时已属肿瘤晚期, 所以当前罹患口腔癌的患者的预后仍然极差 (其5年生存率约50%) [2-4]。 EGLN3基因因其与线虫的 Egl9基因同源而得名, 又称为PHD3 (Prolyl-hydroxylase 3, 脯氨酸羟化酶3) , PHD3是PHDs家族成员[5]。有研 究显示EGLN3参与多种肿瘤的发生和发展, 并与相应肿瘤患者预后密切相关 [6,7]。然而基于 EGLN3 对口腔癌患者的临床预后的研究目前尚无报道, 本研究 将探讨EGLN3对口腔鳞状细胞癌患者的临床预后影响。 资料与方法 1 数据来源 选取口腔鳞状细胞癌基因表达数据集GSE42743, 包含73例口腔鳞状细胞癌患者 肿瘤黏膜组织、24 例口腔鳞状细胞癌患者的正常口腔黏膜组织以及 5例正常志 愿者的正常口腔黏膜组织进行基因表达谱检测。口腔鳞状细胞癌数据集 GSE42743[8]原始数据 CEL文件下载于公共基因表达数据库 GEO (gene expression omnibus) 数据库, 该数据采用 Affymetrix公司HG-U133_PLUS_2 型号的基因表达芯片进行基因表达谱检测。采用 R/bioconductor Affy 和affy PLM程序包对GSE42743的原始CEL文件进行治疗控制后, 使用affy程序包中rma 函数对该数据集进行背景校正 (background correction) , 标准化 (normalization) 以及汇总 (summarization) 后得出该数据集中所有基因的相 对表达水平以进行后续分析。 2 实验方法 以EGLN3 (219232_s_at) 在GSE42743数据集中所有样本表达值的中位数, 为了 进一步明确EGLN3基因对口腔鳞状细胞癌细胞的具体作用机制, 根据EGLN3基因 表达值的中位数, 73 例口腔鳞状细胞癌样本分为 EGLN3基因高表达组和 EGLN3 基因低表达组。分析 EGLN3基因与口腔鳞状细胞癌患者年龄、性别、吸烟情况、 肿瘤部位、T分期、PN 分期、CN 分期以及AJCC 分期、总生存期及口腔鳞状细胞 癌特异性总生存期间的关系。 根据GSE42743 数据中的口腔鳞状细胞癌组织和癌旁正常肺组织分组, 分析 EGLN3基因在口腔鳞状细胞癌组织和癌旁组织之间的表达情况。以 hallmark 基 因集作为参考基因集, 置换次数为1000次, 以P<0.05、FDR (false discovery rates) <0.25使用基因集富集分析 (gene set enrichment analysis, GSEA) 法 分析EGLN3 基因对口腔鳞状细胞癌细胞增殖可能的作用机制。 3 统计分析 采用SPSS21.0 统计软件 (IBM公司, 美国) 进行统计分析, 使用χ 检验分析 EGLN3基因在不同年龄阶段、性别、是否吸烟、肿瘤部位、T分期、PN 分期、CN 分期以及AJCC分期的口腔鳞状细胞癌患者中分布情况。log-rank法对 EGLN3高 表达和EG-LN3低表达组口腔鳞状细胞癌患者的总生存期进行分析, 并运用 Graphpad 5.0软件绘制相应的生存曲线。两独立样本T检验比较EGLN3 基因在 口腔鳞状细胞癌组织和癌旁正常组织中的表达差异情况。EGLN3在口腔鳞状细胞 癌及正常组织中的表达值以 x珋±s表示。以 P<0.05表示差异具有统计学意义。 结果 1EGLN3 基因表达 EGLN3基因在口腔鳞状细胞癌组织中的相对表达值为 (9.157±1.1673) 明显高 于在正常组织中的相对表达值 (7.807±0.4709) , 两组比较差异具有统计学意 义 (P<0.0001) (图 1) 。 图1 口腔鳞状细胞癌组织和癌旁正常组织中EGLN3基因的表达情况 下载原 图 2 EGLN3 基因与口腔鳞状细胞癌患者患者的临床病理相关性 EGLN3基因的表达与口腔鳞状细胞癌患者的年龄、性别、吸烟情况、肿瘤部位无 明显相关性, 但是 EGLN3高表达组口腔鳞状细胞癌患者在 T分期、CN 分期 (临 床分期) 、PN分期 (病理分期) 、AJCC分期方面明显劣于 EGLN3低表达组口腔 鳞状细胞癌患者 (相应的 χ检验P值为P=0.017, P=0.001, P=0.04, 以及 P=0.02) (表1) 。 表1 EGLN3 基因与口腔鳞状细胞癌患者临床病例特点的相关性 下载原表 3 EGLN3 基因对口腔鳞状细胞癌患者生存期的影响 GSE42743数据集中 EGLN3高表达组和EGLN3 低表达组口腔鳞状细胞癌患者总生 存期和口腔鳞状细胞癌特异性生存期。EGLN3 高表达组口腔鳞状细胞癌患者总生 存期明显低于EGLN3低表达组口腔鳞状细胞癌患者 (HR=0.27, 95%CI:0.14~0.53, log-rank P<0.0001) (图2A) 。EGLN3高表达口腔鳞状细胞癌患者的口腔鳞状细 胞癌特异性总生存期明显低于 EG-LN3低表达组口腔鳞状细胞癌患者 (HR=0.20, 95%CI:0.08~0.49, log-rank P<0.0001) (图 2B) 。 4 基于 EGLN3 基因的 GSEA分析 GSE42743数据集中 73例口腔鳞状细胞癌样本分为 EGLN3基因高表达组和 EGLN3 基因低表达组。对 EGLN3基因进行基因集富集分析, 如所示, EGLN3 基因高表达 组主要富集在m TORC1、E2 F、MYC、NOTCH 信号通路以及 PI3 K_AKT_m TOR、蛋 白分泌、有丝分裂、细胞周期 G2M检查点、糖酵解、胆固醇代谢以及去折叠蛋白 反应等功能基因集, 其中以m TORC1相关信号通路富集最为明显 (NOM P<0.0001, FDR<19%) (表2) 。 图2 EGLN3 基因对口腔鳞状细胞癌患者生存期的影响 表2 基于 EGLN3基因的 GSEA分析 下载原表 讨论 口腔鳞状细胞癌患者发病率高、 临床预后较差, 因此寻找新的临床预后标志物对 口腔鳞状细胞癌患者的诊断危险分层和临床预后具有重要意义。 本研究结果表明 EGLN3 (egl-9 family hypoxia inducible factor 3) 在口腔鳞状细胞癌患者中 的表达明显高于其正常对照组, 高表达EGLN3 基因的口腔鳞状细胞癌患者的多 项临床表型明显差于 EGLN3低表达的口腔鳞状细胞癌患者 (包括T分期、PN分 期、CN 分期以及AJCC 分期) , 此外高表达 EGLN3基因的口腔鳞状细胞癌患者的 总生存期和口腔鳞状细胞癌特异性总生存期明显劣于低表达 EGLN3低表达患者。 已有多篇文献报道 EGLN3基因与多种肿瘤细胞的增殖密切相关[9-12]。 有研究显 示EGLN3 参与肿瘤细胞的氧代谢和血管生成, 进而影响肿瘤细胞增殖[13]。Tan 等[14]研究表明, 在 188例乳腺癌患者中至少有 50%的患者乳腺组织中有超过 1 种PHD 家族成员的表达。在胰腺内分泌癌中, 肿瘤细胞核中PHD1、PHD3的高表 达的患者临床分期较低表达患者恶性程度更高以及临床预后相对较差[15]。 Foca 等[16]也有类似的报道, 他们发现在子宫内膜癌组织中 PHD3呈高表达, PHD3可 能影响HIF-2α代谢而影响肿瘤细胞增殖。 前期研究还表明, 口腔鳞状细胞癌患 者的临床预后与患者的临床分期 (包括TNM 分期以及AJCC分期) 密切相关, 分 期越高的患者临床预后更差[17,18]。以上研究结论与本研究结果类似, 本研究 结果表明高表达EGLN3 的口腔癌患者的T分期、PN分期、CN分期以及 AJCC分期 较低表达EGLN3的口腔癌患者更差。因此, 以上分析进一步提示, EGLN3 基因可 能促进口腔鳞状细胞癌细胞增殖, 进而与口腔鳞状细胞癌患者的不良预后密切 相关。 本研究中, GSEA分析结果进一步表明, EGLN3 可能通过m TORC1、 E2F、 MYC、 NOTCH 信号通路以及PI3K-AKT-m TOR、蛋白分泌、有丝分裂、细胞周期 G2M 检查点, 糖 酵解、胆固醇代谢、去折叠蛋白反应等多种生物学过程影响肿瘤细胞的增殖, 其 中以m TORC1通路富集最明显 (名义P值<0.0001, 错误发现率为19.57%) 。在 口腔鳞状细胞癌中m TOR-HIF1α-VEGF通路的激活能够促进肿瘤细胞的增殖和血 管生成, 使用相应的抑制剂能够抑制肿瘤细胞的增殖[19]。事实上, EGLN 家族 又是HIF 的限速酶, 各PHD亚型在肿瘤血管生成方面发挥着不同作用[5]。 因此, EGLN3可能通过作用于 m TOR-HIF1α-VEGF通路促进口腔鳞状细胞癌的增殖, 并 影响患者的临床预后。 参考文献 [1]Bavle RM, Venugopal R, Konda P, et al.Molecular classification of oral squamous cell carcinoma[J].J Clin Diagn Res, 2016, 10 (9) :ZE18-ZE21. 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