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高脂联合小剂量链脲佐菌素建立实验性2型糖尿病大鼠模型.doc

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高脂联合小剂量链脲佐菌素建立实验性 2 型糖尿病大鼠模型 吴瑛 张勇 姚合斌 海军总医院营养科 中国人民解放军 32150 部队医院 海军总医院内分泌科 摘 要: 目的 探讨建立具有胰岛素抵抗、 近似人 2型糖尿病特征的 SD大鼠模型。 方法 将 36只SD 大鼠随机分为 A组 (对照组即普通饲料组) 6只、B组 (高脂饲料组) 6 只、C 组[普通饲料+小剂量链脲佐菌素 (streptozotocin, STZ) 组]12 只、D组 (高脂饲料+小剂量 STZ组) 12只共4组。C 组、D组大鼠分别在普通饲料和高脂 饲料喂养4周后使用小剂量STZ (30 mg/kg) 腹腔注射5 d。 随机血糖>16.7 mmol/L 且持续2周为建模成功。结果 C组、D组能建立 2型糖尿病SD大鼠模型, 成模 率分别为66.7% (8/12) 、91.7% (11/12) 。结论高脂饲料+小剂量 STZ发病过 程接近自然, 成模率更高, 模型稳定, 是值得推广的 2型糖尿病动物模型。 关键词: 2型糖尿病; 血糖; 高脂; 链脲佐菌素; 模型, 大鼠; 基金:解放军总后勤部保健专项课题 (CWS14BJ38) Study of streptozotocin and high-fat diet inducing type 2 diabetes in a rat model WU Ying ZHANG Yong YAO Hebin Department of Nutrition, Navy General Hospital; Chinese People's Liberation Army 32150; Department of Endocrinology, Navy General Hospital; Abstract: Objective To set up a SD rat model similar to human type 2 diabetes mellitus with insulin resistance. Methods Thirty-six SD rats were randomized into four groups, normal group ( group A, n = 6) , high-fat diet group ( group B, n = 6) , low-does streptozotocin group[group C, streptozotocin ( STZ) , 30 mg/kg, n = 12], and high-fat diet and low-does STZ ( 30 mg/kg) group ( group D, n = 12) . Group C and D were induced by an injection of low-does STZ ( 30 mg/kg) after 4 weeks of normal chow feeding and high-fat chow feeding respectively. Rats with random plasma glucose levels >16. 7 mmol/L for 2 weeks were modeling success. Results Both normal chow feeding associated with low-does STZ ( 30 mg/kg) and high-fat chow feeding associated with low-does STZ ( 30 mg/kg) can establish type 2 diabetes animal model. The diabetes morbidity was 66. 7% ( 8/12) in group C, and 91. 7% ( 11/12) in group D. Conclusion Group D has moderately high blood sugar, insulin resistance, the success rate is high, and can be used as a good model of type 2 diabetes mellitus in relevant research. Keyword: Type 2 diabetes mellitus; Blood glucose; High fat; Streptozotocin (STZ) ; Model, rat; 糖尿病 (diabetes mellitus, DM) 及其慢性并发症已成为严重影响人类健康的 全球性公共卫生问题之一。预计到 2035年, 全球将有近5.92亿人患 DM[1], 其 中2型 DM (type 2 DM, T2DM) 占90%以上。目前 DM的病因及发病机制并未完全 阐明, 因此建立可靠的动物模型, 对T2DM发病机制的研究、治疗和预防至关重 要。目前复制T2DM 动物模型的方法有很多种, 如膳食诱导、药物诱导、基因敲 除、自发性模型等[2], 但存在建模时间长、胰岛损伤重、经费高、不能完全模 拟人类T2DM的发生过程等诸多问题。本研究用链脲佐菌素 (streptozotocin, STZ) 加高脂饲料诱导建立 T2DM大鼠模型, 以筛选出更适合建立此模型的 STZ 剂量和饲料配方, 为优化方法提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物 雄性SD 大鼠36只, 无特定病原体级, 体重 150~180 g, 由第三军医大学动物中 心[SCXK- (渝) -2016-0004]提供。 1.1.2 饲料 普通饲料由第三军医大学实验动物中心提供。普通饲料含碳水化合物 53%、脂肪 25%、 蛋白质22%;高脂饲料为普通饲料添加 10%猪油、 1%胆固醇混合加工而成, 其 中含碳水化合物39%、脂肪42%、蛋白质19%。 1.1.3 试剂及仪器 STZ (美国Sigma公司) -20℃冻存, 柠檬酸、柠檬酸三钠 (天津市津宏化工有限 公司) ;微量血糖仪及配套血糖试纸 (美国强生公司) , BS224S电子天平 (德国 赛多利斯公司) 。 1.2 方法 1.2.1 建模方法 1.2.1. 1 用药及制备 使用柠檬酸和柠檬酸三钠配制成 0.01 mol/L、p H 4.5的柠檬酸缓冲液, 4~8℃ 冷藏保存。使用前用 STZ配制成2%的STZ溶液。 1.2.1. 2 动物饲养及分组 所有SD 大鼠饲养环境为室温 (23±1) ℃, 明暗周期12 h, 相对湿度 50%~60%, 自由进食、水。适应性饲养 1周后随机分为 A组 (对照组即普通饲料组) 6只、 B组 (高脂饲料组) 6 只、C组 (普通饲料+小剂量 STZ注射组) 12只、D组 (高 脂饲料+小剂量STZ 注射组) 12 只4组。 1.2.1. 3 给药途径和剂量 4组大鼠在分组4周后, 禁食、不禁水12 h, 测空腹血糖, 并同时称体重。A组、 B组大鼠按30 mg/kg 注射柠檬酸缓冲液, C 组、D组大鼠按30 mg/kg 连续5 d 腹腔注射2%STZ柠檬酸缓冲液。 1.2.1. 4 成模标准 随机血糖≥16.7 mmol/L 且持续2周为造模成功。 1.2.2 观察指标 1.2.2. 1 一般状况 每日观察各组大鼠进食、饮水、排尿量及死亡情况, 每周称重1次。 1.2.2. 2 血清生化指标 建模后分别于第3、7、14天尾静脉测定血糖。实验大鼠于处死前空腹 12 h禁食、 不禁水, 测完空腹血糖和体重后乙醚麻醉大鼠, 静脉采血, 放射免疫分析法测 定空腹胰岛素。 1.2.2. 3 苏木精-伊红染色 大鼠处死后, 立即取出骨骼肌组织, 放入甲醛溶液中浸泡;肌肉组织石蜡包埋, 切片后行苏木精-伊红染色, 观察大鼠骨骼肌组织变化。 1.3 统计学处理 应用SPSS 18.0软件, 计量资料以均数±标准差 表示, 组间比较采用 t检验, P0.05) ;建模后的C组、D组体重明 显低于A组, 差异均有统计学意义 (t分别为 3.257、4.804, P分别为 0.009、 0.001) , 且D组体重下降明显。见表 1。 2.3 随机血糖 建模前, 各组随机血糖值均在正常范围 (4~6 mmol/L) 。建模后, A 组、B组随 机血糖值仍维持在正常水平, C组8只、 D组11只随机血糖值维持在16.7 mmol/L 以上且持续2周。C 组、D组在建模后随机血糖值高于 A组, 差异均有统计学意 义 (t 分别为 14.290、21.244, P均为0.000) 。见表1。 2.4 空腹血糖和胰岛素水平 建模后C组、 D组空腹血糖高于 A组 (t分别为 16.023、 14.290, P均为 0.000) , B组空腹胰岛素高于 A组 (t=2.999、P=0.013) 。见表1。 表1 建模前后大鼠体重、随机血糖、空腹血糖、空腹胰岛素 下 载原表 3 讨论 理想的DM动物模型应该具有相似的发病诱因、发病过程和临床特征, 高血糖动 物模型是否能在一定程度上代表临床 T2DM的病理特征, 是评判动物实验模型成 功的关键。本研究将高脂饮食与 STZ干预相结合, 采用成年SD大鼠高脂喂养 1 个月后, 产生胰岛素抵抗, 再给予小剂量STZ 腹腔注射成功诱导出病理、 生理改 变接近于人类的T2DM 模型。 3.1 实验动物的选择 目前国内外对 DM 动物模型的研究很多, 常根据不同的实验目的选择不同的动物, 国内临床研究采用最多的是 SD、Wistar大鼠。由于大鼠在建模过程中会出现多 饮、多食、多尿及体重明显减轻等 DM症状, SD 大鼠与Wistar大鼠相比病死率 低, 抵抗力更强[3], 且少见自发缓解现象[4-5], 因此本实验选用了无特定病 原体级的成年SD大鼠作为研究对象。 3.2 方法的选择 由于单纯高脂饲料喂养周期长, 饲料成本较高, 因此许多研究都选择药物联合 诱导的方法;然而药物诱导 DM模型也因药物选择、给药方式、给药剂量的不同, 其成模效果也不同。 给动物大剂量注射四氧嘧啶或 STZ后破坏胰岛细胞, 导致胰 岛素分泌障碍, 比较符合 1型DM特征;多次小剂量注射 STZ、高脂饮食+小剂量 STZ联合使用诱发 DM 模型比较符合T2DM特征[6-7]。本实验采取高脂饮食+小剂 量STZ 腹腔注射, 对组织毒性小, 动物存活率高, 且更好地模拟了人类 DM的发 生过程;实验结果也显示, 高脂饮食可使大鼠体重明显增加, 形成胰岛素抵抗, 再给予小剂量STZ血糖明显升高且保持稳定水平, 成模率较高。 在注射部位选择 上本实验采取腹腔注射, 方法易于掌握, 避免了静脉注射中因用药过量和速度 过快导致心力衰竭[8], 注射部位固定也可保证成模后血糖数据的稳定性[9]。 3.3 注射剂量的确定 关于STZ 的用量, 很多研究报道不一, 小剂量一般在 25~40 mg/kg、大剂量一般 在50~70 mg/kg[10-13], 病死率也随着用药剂量的增大而增高[13]。反复小剂 量或大剂量一次性注射易造成胰岛细胞直接损伤, 比较了有关文献报道后本实 验选择30 mg/kg的剂量;实验结果也显示, 此剂量条件下成模大鼠血糖值和胰岛 素水平明显升高, 具有胰岛素抵抗、高血糖、高胰岛素血症的 T2DM 临床特征。 3.4 成模标准的确定 关于DM大鼠成模水平的判断, 目前国内外的研究对DM模型判定标准不一, 大多 数研究倾向于空腹血糖>7.8 mmol/L或随机血糖≥16.7 mmol/L[14-15]。由于空腹时间大于12 h, 易造成低血糖且容易造成 DM症状较重的大鼠死亡, 因此选择 随机血糖更为灵活、操作性更强。为了避免病情自发缓解的问题, 分别在建模后 第3、7、14天测定血糖, 以建模后14 d随机血糖仍维持在 16.7mmol/L 以上作 为模型成功的标志, 确保了模型的稳定性。 DM是一种由代谢系统紊乱引起的内分泌疾病, 其主要发病机制为胰岛素相对不 足且伴随有胰岛素抵抗。 本研究在借鉴前人研究的基础上将高脂饮食与 STZ干预 相结合, 采用成年 SD大鼠高脂喂养联合小剂量 STZ腹腔注射的方法诱导实验鼠 出现多饮、多食、多尿等 DM症状, 体重明显下降, 血糖明显升高且出现胰岛素 抵抗, 其病理、生理改变接近于人类 T2DM模型, 具有时间短、成模率高、血糖 水平稳定的特点, 是值得推广的 T2DM模型。 参考文献 [1]Xu Y, Wang L, He J, et al.Prevalence and control of diabetes in Chinese adults[J].JAMA, 2013, 310 (9) :948-959. 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