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北京化工大学北方学院波谱分析课件-质谱课.ppt

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北京化工大学北方学院波谱分析课件-质谱课.ppt
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波谱解析课程——质谱,第一节,质谱技术及原理,质谱分析法( Mass Spectrometry ) MS,质谱分析方法(Mass Spectrometry, MS)的应用最常见的是对化合物进行分子量和元素组成的确认。随着质谱分析中新型电离技术的不断开发和完善,目前基本上建立了适用于大多数化合物(包括天然产物、合成物和生物分子)的不同质谱分析方法。在有机质谱分析中,目前使用最多的是电子轰击质谱(EI-MS)及化学电离质谱(CI-MS)、快原子轰击质谱(FAB-MS)、电喷雾电离质谱(ESI-MS)和大气压化学电离质谱(APCI-MS)等,虽然基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)亦可用于测试一般小分子的化合物,但它更广泛地应用于多肽及蛋白质等生物大分子的分析(生物质谱)。,概述,对于现代质谱技术而言,近20年来新型离子化技术(离子源)的不断开发,及其与HPLC仪联用的LC-MS技术的实现和日趋完善,串联质谱技术(MS/MS)的改进和类型、功能的多样化以及新型质谱技术的发展可以用‘日新月异’一词来描述。,概述,质谱分析法是将样品通过离子化,产生气态离子,并按质荷比(m/z)分离、分析的技术,质谱图是按质量数大小(m/z)排列起来的谱图。,,进样系统:将分析样品导入离子源的装置; 包括: 直接进样, GC, LC及 接口, 参考物或靶气气体进样等,离子源: 使被测样品分子离子化成为带电离子的装置, 并对离子进行 加速使其进入分析器,质量分析器: 将离子按不同质荷比(m/z)大小分离的分析部分; 离子通过分析器后,按不同质荷比分开,并将相同的质荷比离子聚焦在一起, 从而形成质谱。,检测分析器: 接收离子束并将电信号放大的装置,控制及数据处理系统: 处理并给出分析结果, 现代计算机还可以控制 质谱仪进行各项工作,真空系统: 利用机械泵, 扩散泵或分子泵等, 抽取离子源和分析器的空气并达到高真空, 使离子从离子源到达接收器,质谱仪的组成及其主要作用,phe-1中[M+H]+离子的FAB-MS/MS谱,质谱图示例:,1. 质谱法的发展历史,,质谱分析法从最初的进行各种元素质量及其天然同位素质量和丰度(存在比)的测定开始,到目前可进行不同大小分子的质量和精确质量数测定。目前按研究领域已经发展成为四大类:同位素质谱、无机质谱和有机质谱(现分出有机质谱和生物质谱)。本课程只讨论与我们相关的有机质谱(部分生物质谱)内容。,,现在的有机及生物质谱法,不仅可以进行小分子到蛋白质及DNA等生物大分子的分子量测定和结构解析,而且通过对在生物学上具有功能的生物及有机分子的分析,还可提供有效的‘生物功能’信息。早在1994年美国《分析化学》杂志登载的质谱学综述中指出:‘生物质谱学的时代已经到来’。与之相应的是这十多年来,质谱分析方法确实在生命科学领域里很活跃,甚至对推动生命科学的整体发展起到了巨大作用,目前无论在基因组学、蛋白质组学,还是代谢组学,质谱技术已经成为最强有力的手段(或技术平台)之一(由此从有机质谱领域分出了生物质谱)。当然,世界科学界的兴趣从‘无机性’的物理世界开始转向神秘的有机生命的世界,也实属现代自然科学的一种趋势。,现代有机及生物质谱技术的作用◆ 分子量及结构信息:数十 百万Da 分子量的测定 小分子   大分子的结构分析◆ 混合物成分信息: 利用MS/MS或LC-MS/MS技术,可同步完 成微量成分的高灵敏度分离、鉴定结构以 及定量分析。◆ 生物功能信息:  结合生化学、生物学,提供生物及有机分 子的 “生物功能”作用信息(如在组学中的 应用)。,,,,,质谱技术的主要特点及功能,,★(高)灵敏度是质谱的“生命”★离子化(技术)是质谱的“心脏” 如, 2002年度化学诺贝尔奖授予给了J.B. Fenn和田中耕 一等三人;由于他们二人“发明了可分析生物大分子的质 谱分析法”,即电喷雾电离质谱(ESI-MS)和基质辅助激 光解吸电离质谱(MALDI-MS)。★主要功能:(1)(最基本)提供分子量信息;(2)根据MS/MS或MSn等,(定性)结构分析;(3)根据LC-MS/MS方法,进行定量分析。(4)在组学中的应用……,近二十年来,质谱技术有了飞跃发展,主要表现为以下三方面:■ 离子化技术(包括接口技术)的创新和不断 改进■ 串联质谱和联用技术(MS/MS,LC-MS/MS 等)的开发和不断完善■ 敞开(开放)式质谱新技术(Ambient Mass Spectrometry)的出现 (新飞跃),2000年提出冷喷雾质谱(Coldspray Ionization)技术。2004年以来开放环境下实现离子化的新型技术—敞开式质谱方法(Ambient Mass Spectrometry)的出现尤为关注。代表性的有DESI(解吸电喷雾)和DART(直接实时检测)等电离技术。其主要特点是不需要在真空环境下实施电离、不需要样品的前处理,且适用于气体、液体和固体样品等。在爆炸物、毒品,药代动力学、高通量药物筛选、药物及药品和癌症诊断的快速检测等方面得到了成功的应用。2006年,LTQ Orbitrap(组合)型质谱仪的研发成功,改变了离子阱和高分辨的发展模式;2007年HDMS型串联质谱仪的推出提高了质谱的分离、分辨功能。,最新技术,,,,水的复合物峰,DART (R. B. Cody, et al, Anal. Chem., 2005, 77, 2297),固体表面分析活体动物、体内分析无毒性化学试剂污染高灵敏度,Extractive Electrospray Ionization (EESI)-MS,Synapt HDMS system,Resolution: 7500,15000,30000,60000,100000,Orbitrap型,质谱分析仪器的发展趋势主要向着灵敏、专一、准确、简便、快速的方向,随之而来的是技术及仪器的智能化、多样化、微型化及复合型。未来的技术及其应用 。。。。。。!,未来技术,1910-40年代(黎明期),1940-80年代(成熟期 ),F.W.Aston和A.J.Dempster的时代,1910-1912年,1920-1940年,,应用开发及前景,,仪器开发,新技术发展,现状(发展期 ),质谱发展史,1886年,E. Goldstein在低压放电试验中观察到正电荷粒子,随后W. Wein发现正电荷粒子束在磁场中发生偏转,这些结果为质谱技术的诞生奠定了基础。 从二十世纪初(1910年),被誉为现代质谱学之父的英国科学家J. J. Thomson(发现电子)进行“阳粒子线分析”(positive ray analysis)研究的时代开始,直到F.W. Aston和A. J. Dempster等人开创的‘真正’质谱分析法及其应用的发展,这约40年可称之为质谱分析法的‘黎明期’。,,1910-40年代(黎明期):,注:J. J. Thomson因气体导电性理论及实验研究,获得诺贝尔物理奖(1906)。,上世纪50-60年代以后,真空技术、电子技术以及精密制造等技术的迅速发展,亦推动了质谱分析中新技术的开发。 (1)CI-MS:1966年,F.H. Field在M.S.B. Munson的协助下,根据离子—分子间多次碰撞发生高压气相离子-分子反应这一点,研制出了新型离子源,即‘化学电离离子源’( CI, Chemical Ionization , ion source )。,新技术开发,CI-MS的特点是,首先以电子轰击被称为反应气体(reactant gas)的CH4、H2、NH3等气体使其离子化,并发生离子-分子反应,产生CH5+ or C2H5+、H3+、NH4+等离子,然后与样品分子发生离子-分子反应,达到使分子离子化的目的,一般常产生 [M+H]+、[M-H]+等‘准分子离子’。因为是一种‘软’电离技术,与EI法相比,比较容易产生分子离子峰。,新技术开发,(2)FD-MS:1969年,H.D. Beckey开发了‘场解吸电离法’(FD, Field Desorption),这种离子源主要应用于难挥发性有机化合物的离子化。此技术比较广泛的使用了近10年,虽然,目前仍在使用,但是它的主要作用基本上被1981年发表的FAB-MS法所取代。,新技术开发,(3) FAB-MS:1981年,M. Barber等研制出了被称为‘快原子轰击电离法’(Fast Atom Bombardment, FAB)。它主要用于热不稳定、难挥发性以及低极性至较高极性的有机化合物的离子化,是目前比较常用的电离技术。,新技术开发,(4)LSI-MS:1966年,首先J.F. Hennequin等开发了主要使用于固体表面分析的二次电离质谱(SIMS: secondary ion mass spectrometry),后来又被进行多次改进。特别是1976年以后,此技术逐渐发展成为在有机质谱中常用的liquid SIMS(LSI-MS)。,新技术开发,1982年,A.L. Burlingame等进行了FAB ( 8keV, Xe )与 LSI ( 6keV, Cs+ ) 质谱的比较研究,表明二者提供的谱图(型)基本上一致。总之,FAB与LSIMS应用至今,大大提高了质谱分析法的应用面,例如,现实了使分子量从1,000扩大到3,000的相对大分子的测定。,新技术开发,(5)GC/MS:为了对混合物进行分离、分析,因此需要与具有分离能力的色谱手段连接使用。上世纪60年代首先完成了气相色谱技术与质谱仪的联用,简称‘色-质联用仪’(GC/MS)。GC/MS仪仍然是目前最成熟、应用最广泛的联用技术之一,但是,该技术受气相色谱以及EI(CI)电离对样品的极性和热稳定要求,对分析极性大、热不稳定有局限性。,新技术开发,进入80年代以后,质谱法的发展可以归纳为两个主要方面。,新型电离技术,联用技术,,电喷雾,,,大气压化学,基 质 辅 助 激 光 解 析,串联质谱,液质联用,,,1984年前后由B.A. Thomson和 J.B. Fenn等人开发,但确立为软电离法是1987年以后,认为是目前最‘软’电离技术。1988年由J.B. Fenn等应用于测定一万Da分子量以上蛋白质分子后引起广泛重视。,1987年被正式确立, 用于弱极性的小分子化合物。,1987年以后由F.Hillenkamp和K.Tanaka等人正式确立为软电离方法。 主要用于蛋白质等生物大分子的测定。1987年,Tanaka等测出72,000Da分子注:2002年,J.B. Fenn(约翰•芬恩)和K.Tanaka(田中耕一)因为“发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法”和“发明对生物大分子的质谱分析法”获得了诺贝尔化学奖。,新型电离技术,为了弥补GC-MS技术难以分析极性大和难挥发性化合物的不足,经过20多年的探索,通过开发上述几种软电离技术,特别是ESI和APCI等,解决了LC与离子源接口问题(1987年完成),从而实现了LC-MS或LC-MS/MS的联用仪,是分析化学的一次重大进展。,1973年由R.G. Cooks和F.W. McLafferty等人正式提出了MS/MS(CID)方法,此技术原理将在下面介绍。,另外,FT-ICRMS在80年代被开发以后,进入90年代日益成熟了。,新(联用)技术,2000年提出冷喷雾质谱(Coldspray Ionization)技术。2004年以来开放环境下实现离子化的新型技术—敞开(常压)式质谱方法(Ambient Mass Spectrometry)的出现尤为关注。代表性的有DESI(解吸电喷雾)和DART(直接实时检测)等电离技术。其主要特点是不需要在真空环境下实施电离、不需要样品的前处理,且适用于气体、液体和固体样品等。在爆炸物、毒品,药代动力学、高通量药物筛选、药物及药品和癌症诊断的快速检测等方面得到了成功的应用。2006年,LTQ Orbitrap(组合)型质谱仪的研发成功,改变了离子阱和高分辨的发展模式;2007年HDMS型质谱仪的推出提高了质谱的分离、分辨功能。,最新技术,,,,如果在离子源被电离的样品分子质量为m,电荷为 z (e),(S1)加速电压为V,(电场作用能量为:zV;则离子被加速的速度为v,获得动能为:1/2mv2。 1/2mv2 = zV (1),受到磁场(磁场强度B)中磁力的作用,沿磁场曲线半径R的轨道发生偏转,在做曲线运动时,此离子受到离心力作用,即mv2/R。同时,该力与磁力(向心力)zvB 达到相当时,此离子才能通过磁场,进入检测系统被记录。 mv2/R = zvB (2),第一节、单聚焦和双聚焦质量分析器,一、单聚焦磁质谱离子源内:磁场中:向心力:zeV=(1/2)mv2 离心力:zevB=(mv2)/rmz: 电荷数,V:加速电压,m:离子质量B:磁场强度, rm:运动的曲率半径不同质荷比离子的偏转半径不同V: 有8000v 和10000v m/z=(ermB2)/(2V) 磁场的作用:1.质量色散 2.方向聚焦,,,由(2)整理后得到:v =zRB/m (3) 将(3)式代入(1),整理后得到(4)式, m/z =R2B2/(2V) (4)(z=1,2,3..., 一般Z=1时,常用ze表示) (4)式为磁质谱的基本公式,此式左边的m/z 称为质荷比,为质谱的表示单位,,二、双聚焦磁质谱 电场的作用 re=(2V)/E re:与离子质量无关 作用:1. 能量色散 2.方向聚焦思考题:1.如何提高分辨率? 质谱仪的分辨本领由几个因素决定: (1)离子通道的半径; (2)加速器与收集器狭缝宽度; (3)离子源的性质。2.如何提高质量范围?3.需要连续型或脉冲型离子源?,,当磁场半径R固定时(对某离子而言,R是一定的),通过改变磁场强度B或加速电压(一般固定电压)进行扫描,便可使不同质量的离子依次检测记录下来,按离子m/z的大小顺序(先小,后大)排列,以线形峰的形式记录,横坐标为m/z,纵坐标为离子强度(常用相对强度表示)。,m/z = R2B2/(2V),通过加在四极杆上的交变电压,改变电压和频率进行扫描。从而允许一定质量(速度)的离子通过四极场到达接受器(是电场扫描)。 m/z = 2E/v2 其中:E=电压(离子动能),v = 离子速度,,,利用相同能量的带电离子,由于质量的差异而具有不同速度的原理,实现不同质量的离子以不同时间通过相同的漂移距离(领域)到达接受器。 m/z =2E/v2, v =d/t 代入左式得到 m/z =Kt2 (k =2E/d2) (d:飞行距离;t:飞行时间 ),,,,,,,,Flight Tube,Detector,Ion Source,,What is Time of Flight (TOF)?,,,,,,,,,,,,,,The lighter ions strike the detector before the heavier ions.This “time of flight” can be converted to mass,,,4-25 kV,,在射频电场和正交(横)磁场作用下,离子做螺旋回转运动,回旋半径越转越大,当离子回旋运动的频率与补电场射频频率相等时,产生回旋共振现象,测量产生回旋共振的离子流强度,经‘傅立叶’变换计算,最后得到质谱图。该技术比较有利于(很)高分辨率的测定,研究高质量数,多级离子分析。,,FT-ICRMS,第二章、质量分析器,在静态仪器中用稳定的电场,按空间位置将m/z不同的离子分开; 在动态仪器中用变化的电场,按时间不同来区分m/z不同的离子。,质谱仪器,,静态仪器,动态仪器,,,,,单聚焦磁质谱、双聚焦磁质谱,,四极质谱、离子阱质谱、飞行时间质谱、FTMS,通过MS1的离子源使样品离子化后,经第一分析器可选择一定质量的离子作为母体离子,使其进入碰撞室,利用室内充有的靶气(碰撞气体:He、Ar、Xe、CH4等)对所选离子进行碰撞,发生离子—分子碰撞反应,从而产生‘子离子’,再经MS2的分析器及接受器得到子离子(扫描)质谱(product ion spectrum, PROS),上述方法得到的谱图一般称做MS/MS-CID谱,或者简称为CID谱(collision-induced dissociation, CID)碰撞诱导裂解谱,或MS/MS谱。另外,也有母找子离子的母离子(扫描)谱( precursor ion spectrum,PRES),以及中性丢失扫描谱(neutral loss scan spectrum, NLS)。,QTRAP型串联质谱仪的构成原理图,MS/MS的基本原理,研究MS/MS谱(一般指子离子谱),可以了解到被分析样品的混合物性质和成分,对一些混合物(目前,多用最软电离的ESI或APCI的MS/MS。不必进行色谱分离可直接分析,与色谱法相比,有很快的响应速度,省时省样品省费用,具有高灵敏度和高效率的优点。另外一个特点是通过子母及母子MS/MS谱以及NLS谱的分析,可以掌握丰富的结构信息。目前作为有力的结构解析手段。,利用串联质谱仪进行药物研究越来越得到重视,特别是在药物代谢以及混合物的微量成分分析和快速结构分析等方面正在起到越来越重要的作用。可以这么说,MS/MS及LC-MS/MS技术已经成为一个不可缺少的分析手段。,FAB-MS谱,ESI-MS谱,由于不同结构类型的化合物性质差异很大,因此,首先需要针对性地选择适合于不同类型化合物的离子化方法,甚至正、负离子检测方式的合理使用。随着质谱分析中新型离子化技术的不断开发和完善,目前基本上确立了适用于大多数有机化合物的不同离子化方法。应用广泛的离子化技术主要有电子轰击电离(EI)、化学电离(CI)、快原子(离子)轰击电离(FAB/LSI)和电喷雾电离(ESI)等,虽然基质辅助激光解吸电离(MALDI)亦可用于测试一般小分子化合物,但它更广泛地应用于多肽及蛋白质等生物大分子的分析中。,质谱分析的主要离子化技术:,质谱分析的主要电离技术及其应用范围:,,EI-MS: 高挥发性、一般分子量≤1,000 Da的化合物,,CI-MS: 高挥发性、一般分子量≤1,000 Da的化合物,FAB-MS: 热不稳定、难挥发性、中等极性,分子量 ≤ 3,000 Da的化合物,,……,ESI-MS: 热不稳定、中至高极性,可检测到数十万Da分子量 的化合物,混合物,此外(包括APCI-MS,相对弱极性分子)真正实现了LC-MS技术。,,MALDI-(Tof)MS : 主要用于蛋白质等生物大分子的测定(可检测到近百万Da分子量 )。,,EI,CI,FAB,ESI,MALDI,电子轰击电离方法(EI)是通过具有一定能量的(轰击)电子直接作用于被气化的样品分子,使其电离的离子化技术;它是一种分别实现样品的气化与离子化的典型方法,也是应用最长久的经典方式。由于首先对被测样品在进样系统中的玻璃管或金属管中加热气化,同时在一定能量的电子轰击下实现电离,因此EI技术属于‘硬’电离方法。,,EI法(Electron Impact Ionization),,EI法(Electron Impact Ionization),通常采用金属钨或铼制成的灯丝在高真空中被电流加热发射出电子,电子在电离电压加速下进入离子源电离盒中,电离盒内处于高真空(10-4 Torr)的状态,样品在进样系统被加热气化后,被导入电离盒扩散在电子束当中,从而使气态分子受到电子束的轰击失去电子产生正电荷的分子离子M +•及其碎片离子。电离电压(能量)通常设定为70eV。,M + e -  M z+ + (z+1)e - (z1) (1)M + e -  M- • (2),产生的离子被离子源中的排斥电极推出离子源,然后被加速电压(S0)送出S1进入质量分析器。由于处于真空状态,在EI法中,一般可以忽略离子与分子间的相互碰撞,则认为EIMS中的反应是单分子反应。,由于伴随着热分解反应,以及电子动能的一部分转移到分子内部,是分子内部能量过剩,产生大量的碎片离子。,同时具有一定热能量(0.1~0.01ev)的轰击电子,由于在分子电子亲和力(EA)作用下被捕获,形成负的分子离子,但是灵敏度低,一般不使用。,特点,技术成熟,离子源结构简单 ;峰重现性好,具有标准数据及图谱库、 适用于检索; 离子化效率高,碎片离子多,提供一定的结构信息缺点(应用范围比较窄) 不适合极性大、热不稳定性化合物;分子量有限,一般≤1,000 Da。,一、电子轰击电离 (Electron Impact, EI),1、组成部分 灯丝:钨、铼或铼钨丝,发射电子,电离样品 收集极:接收灯丝发射的电子 推斥极:推出产生的样品离子 永久磁铁:使电子做螺旋运动,增加电离几率,2、电离效率曲线 灯丝产生的电子被加速到70eV,保证电离的重现性。为什么? 电离效率随电子能量的升高而升高,当达50eV时,基本达到最大值,实验上设定电子能量为70eV。 此时,产生的谱图有稳定的指纹特征。,电离效率曲线,电子能量对质谱图的影响,不同能量下获得的苯甲酸的质谱图,分子,,+,分子离子,碎片离子,子离子,母离子,CI法亦是一种样品的汽化与离子化分别实施的电离法典型。虽然,它也不适合对易热分解的化合物,但是,因为要利用离子分子反应来实现离子化,因此是‘软电离’法。并且可以说是其它软电离法,如FAB、MALDI、APCI、TSP等的基础,同时是气相离子化学的主要技术。在CI离子源中,首先用电子轰击导入的反应气体,使其离子化。,,化学电离法(CI, Chemical Ionization),由于离子源中充满反应气体,而且相对为高压(1~数Torr,即~102级Pa),因此发生多次离子—分子碰撞,通过交换电荷发生离子—分子反应,还与过量的反应气体发生‘二次’离子等。,B + e - B+• + 2e - (1) (电子电离)B+• +B  (B+H)+ + (B-H)• (2) (氢转移)   (B-H)+ or (B-H)- (3) (多次反应)   b- or b- • (4) (碎片离子) B + e -  B- • (5),(B为反应气体,常用异丁烷、甲烷、氨气、氢气等 ),然后,往这种‘气雾’中提供与EI法同样的加热汽化的样品分子。从而,随着反应离子(大量充满离子源)与样品分子(M)的相互作用,实现离子化(电离),则称之为“化学电离法”。离子—分子反应主要有:在离子化能量作用下进行电荷交换反应,在质子亲和力作用下,进行质子转移(反应)等。,M + B+•  M+• + B (6) (电荷交换)M + (B+H)+  (M+H)+ + B (7) (质子转移)M+• + (B-H)+  (M-H)+ + B+• (8) (脱氢)M + (B+H)+  (M+B+H)+ (9) (加合离子),根据不同反应气体的选择,可以使样品分子有所选择地电离,同样不同类型的分子能被特定的正或负反应离子有选择地电离。例如,胺和醚等含杂原子的分子通常产生大量的[M+H]+,而饱和烃则常产生[M-H]+等。,M + e-  M- • (10) (捕获电子)M + (B-H)-  (M-H)- + B (11) (质子转移)M + B- •  (M+B)- • (12) (离子—分子相互 作用),,化学电离法(CI, Chemical Ionization),特点,,1)与电子轰击法的直接轰击样品相比,因为是通过发生‘离子—分子’反应来实现离子化,则它是一种‘软电离’技术。因此,在EI法中不易产生分子离子的化合物,在CI中易形成较高丰度的[M+H]+或[M-H]+等‘准’分子离子。,2)偶电子离子一般具有较低的内能,因此,得到碎片少,谱图简单,但结构信息少一些。,3)(缺点)与EI法同样,样品需要汽化,对难挥发性的化合物不太适合。,(M.W. 224),甲糖宁的EI-MS与CI-MS谱比较,EI-MS,CI-MS,,
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