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石蜡切片免疫组化步骤.doc

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石蜡切片免疫组化步骤.doc
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石蜡切片免疫组化步骤1.石蜡切片放置在 60℃恒温箱中烘烤 120分钟。2.脱蜡和水化:二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(10min)→95%乙醇(10min)→90乙醇(10min)→80%(10min)4.抗原修复:柠檬酸钠缓冲液 95度,10 分钟. (枸橼酸三钠 3g枸橼酸 0.4g 然后加水到 950 毫升左右,然后用 NaOH 或 HCI 调 pH 值 6.0,最后定容在 1000ml)5. PBS浸洗 2次各 5min6.加 3%H2O2孵育 5min(室温或 37度,避光)。肝组织过氧化物酶含量高。需增加浓度或增长时间。蒸馏水洗 2minx3次8.pbs-曲拉通通透(pv 法不需要)9.与二抗种属一致的血清封闭非特异位点。(pv 法不需要)9.滴加一抗 4℃过夜10.PBS浸洗 3次各 5min11.滴加二抗室温或 37℃孵育 30min12.PBS洗 3次各 5min15.DAB显色 5~20min,自来水充分涮洗16.苏木素复染 2~3min,自来水充分涮洗17.氨水反蓝,过蓝可用盐酸酒精分化 2s,自来水充分涮洗. 用稀氨水返蓝,自来水里加几滴稀氨水,就行了,返蓝时间 5 分钟左右,就很好看了 ;淡氨水有人用 50ml 自来水+三四滴的氢氧化铵;18.脱水、透明 80%(5min)→90%(5min)→95%(5min)→100%(5min)→ 100%(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min)19.封片:中性树脂,加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡),自然晾干二、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前,应将组织芯片放在 60℃恒温箱中烘烤 2h 以上, 然后按以下流程进行:二甲苯Ⅰ(1h)、二甲苯Ⅱ(30min)、100%酒精(30min)、95% 酒精(15min)、70%酒精(15min)、50%酒精(15min)、蒸馏水(15min)2、3%H2O2,室温封闭 5~10 分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。3、甩去 H2O2,蒸馏水洗 2min×3 次。4、抗原热修复:将切片置于装有抗原修复液的玻璃容器中(耐高温),进入微波炉内,容器内液体温度达到 95~100℃后断电,连续三次。5、PBS 冲洗 5min×3 次。6、5%BSA 封闭液 20min,甩去。7、用 0.1mol/L PBS 稀释一抗 100 倍,滴加后 4℃过夜。8、 PBS 冲洗 2min×3 次,滴加二抗 37℃ 20min,PBS 冲洗 2min×3 次,滴加 SABC 37℃ 20min,PBS 冲洗 5min×4 次,显色剂显色。9、自来水冲洗,封片,观察。注意:如果需要做双标记法,则在操作完步骤 8 后,重复步骤 3~8 即可. 评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度(0~3 分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色)、阳性范围进行评分(1~4 分为 0~25%、26~50%、51~75%、76~100% ),最终可以分数相加,再进行比较。1. 1、方法操纵不难,最大的易处是出现非常后果时怎样处理?这就需要把握免疫组化实行道理,每步晓得为何这样做,这样你才敢斗胆地变革先前的不合错误的方法步骤。如抗体孵育条件次要是抗体浓度、温度、时间,这三者通常为互相成反比的(相对),此中浓度是最重要的先决条件,温度决定反应的速率、时间决定反应的量。就拿温度来讲,可以有 4度、室温、37 度,我保举 4度最好,反应最暖和,背景较浅;而 37度反应速度较快,时间较短;室温我不太倡导,除非你每次都把情况温度掌握在必然的范畴,不然,尽可能选择前两者。2、免疫组化最大的上风是定位和定性。比拟于其他蛋白检测方法,免疫组化具有定性灵活度高、定位较直接正确,是定位检测分析尾选方法。特别对于有些因子的转位研究十分有效。3、免疫组化结果定量分析的条件是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析,但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下,分析最为准确,这种原则可能也是我们平常审稿时鉴定研究结果的必备条件。4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对比通常为用必定表达这种抗原的切片来做;阴性对照一般是用 PBS或非一抗替换一抗来进行反应,其他步骤均一致。前者是解除方法和实验体系有无问题;后者是扫除有无一抗外的非特异性染色。5、免疫组化的应用普遍,是当前实验研究的最重要方法之一。现在发 SCI论文时,显着觉得仅靠量化的数据来发文章很难,加一些形态学数据或图片,老外十分接待,多是怕你学术造假吧。固然也不能做假阳性或假阴性结果。6、免疫组化技术掌握与否的审定尺度是同统统片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出良好的染色切片。我在日常平凡带教中就发现很多研究生把我已经摸索很成生的反应条件、浓度、方法步骤,反复使用于同一性子
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