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HE石蜡切片步骤,免疫组化步骤.doc

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HE石蜡切片步骤 免疫组化步骤.doc
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HE 染色1.取材切取的组织块不宜太大,以利于固定剂穿透,通常以 6mm×6mm×5mm 为宜。注意事项:(1)取材动作要迅速,不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。(2)切片材料应根据需要观察的部位进行选,尽可能不要损伤所需要的部分。2.固定将切好的组织用生理盐水组织洗 3 次,立即投入 10%中性福尔马林固定液或 4%多聚甲醛中固定,固定 36 小时。注意事项:(1)一般固定液,都以新配为好,配好后应贮存在阴凉处,不宜放在日光下,以免引起化学变化,失去固定作用。(2)有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用,一定要在使用前才混合,如果混合太早,固定时就没有作用了。(3)固定材料时,固定液必须充足,一般为材料块的 20~30 倍,有些水分多的材料,中间应更换 1-2 次新液。(4)材料固定完毕后,保存于严密紧塞或加盖的容器里,同时在容器外上标签,并随同材料在溶液中投入相应的标签,以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字,应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。脱钙 72 小时中间不换液是样本 30 倍 中杉金桥(进口脱钙液)镊子触质粒由硬变韧性为准。(美):固定 3-5 天根据组织大小确定天数,越大固定时间越长。3. 洗涤材料经固定后,PBS 或双蒸水冲洗约 3 小时。 (20,30,30,60)(美):流水冲洗约 4 小时4. 脱水材料依次经 80%、90%、100%、100%各级乙醇溶液脱水,各 30min注意事项:(1)脱水必须在有盖的玻璃品中进行,防止吸收空气中的水分。(2)在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料以免损坏,可用吸管吸出器皿中的脱水剂,再用吸水吸尽器皿内剩余液,然后于皿中加入高一级脱水剂。(3)在低浓度酒精中,每级停留不宜太长,否则易使组织变软,助长材料的解体。(4)在高浓度或纯酒精中,每级停留的时间也不宜太长,否则会使组织变脆,影响切片。(5)如需过夜,应停留在 80%酒精中。(6)脱水必须彻底,否则不易透明,甚至使透明剂内出现白色混浊现象(美):80%的酒精×2 小时95%的酒精×2 小时100%的酒精×2 小时×2100%的酒精×1 小时或者更长时间5.透明(环保透明脱蜡液)中杉金桥纯酒精、二甲苯等量混合液 15min,二甲苯Ⅰ60min、Ⅱ30min(至透明为止) 。由于乙醇与石蜡不相溶,而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡,所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时,光线可以透过,组织呈现出不同程度的透明状态。透明注意事项(1)使用透明剂时,要随时盖紧盖子,以免空气中的水分进入。(2)更换每级透明剂,动作要迅速,一方面为了不使材料块干涸,另一方面能避免吸收湿气。(3)在透明过程中, 如果材料周围出现白色雾状,说明材料中的水未被脱净,应退回纯酒精中重新脱水,然后再透明。(美):二甲苯 2 小时二甲苯 2 小时二甲苯 2 小时6.透蜡放入二甲苯和石蜡各半的混合液 60min,再放入石蜡Ⅰ60 分钟、石蜡Ⅱ透蜡 30 分钟。透蜡的目的是除去组织中的透明剂(如二甲苯等) ,使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。透蜡时间根据组织大小而定。透蜡应在恒温箱内进行,并保持箱内温度在 55-60℃左右,注意温度不要过高,以免组织发脆。一般置于恒温箱 0.5h。透蜡注意事项(1)尽量保持在较低温度中进行,以石蜡不凝固为度;(2)透蜡温度要恒定,不可忽高忽低;(3)操作要迅速,力求在最短的时间内完成石蜡透入过程,以免引起组织变硬、变脆、收缩等。(美):石蜡 2 小时石蜡 2 小时石蜡 2 小时7. 包埋包埋时,用镊子夹取石蜡模子(金属质地)在酒精灯上稍加热,放在平的桌面上,从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯,倒入少许石蜡。再将镊子稍加热,夹取材料将切面朝下放入蜡模中,排列整齐。再放上包埋盒,轻轻倒入熔蜡。8. 切片①将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。②将切片刀固定在刀夹上,刀口向上。③摇动推动螺旋,使石蜡块与刀口贴近,但不可超过刀口。④调整石蜡块与刀口之间的角度与位置,刀片与石蜡切片约成 15 度左右。⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度,一般为 4-10 微米。⑥一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮,让蜡块切成蜡带,左手持毛笔将蜡带提起,摇转速度不可太急,通常以 40-50r/min。⑦切成的蜡带到 20-30cm 长时,右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起,以免卷曲,并牵引成带,平放在蜡带盒上,靠刀面的一面较光滑,朝下,较皱的一面朝上。⑧用单面刀片切取蜡片一小段,放在载玻上加水一滴,置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。⑨切片工作结束后,应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡,把切片机擦拭干净妥为保存。9. 展片、贴片打开水浴锅,使水温维持在 40-45℃,另准
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