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免疫组化、elisa 、western blot 、PT-PCR.doc

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免疫组化、elisa 、western blot 、PT-PCR.doc
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免疫组化 是融合了免疫学原理(抗原抗体特异性结合)和组织学技术(组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等) ,通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素)显色,来对组织(细胞)内抗原进行定位、定性及定量的研究( 主要是定位)。样本是细胞或组织,要在显微镜下观察结果,可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。 elisa(酶联免疫吸附试验) 用到了免疫学原理和化学反应显色,待测的样品多是血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液,因而没有用到组织包埋、切片等技术,这是与免疫组化的主要区别,操作上 开始需要将抗原或抗体结合到固相载体表面,从而使后来形成的抗原-抗体- 酶-底物复合物粘附在载体上,这就是“吸附”的含义。 免疫组化和 elisa 所用到的原理 大致相同,只是因为所检测的样品不同,从而在操作方法上有所不同。Elisa 多用于定量分析,其灵敏度非常高。 western bolt 先要进行 SDS-PAGE,然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上,而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品,可以用于定性和半定量。 免疫学三大工具,免疫组化、Western、ELISA,分别用于定位,定性和定量。 以下western 和 Elisa 的区别不是原创,是找的资料。 western blotting 可以看到特异性的条带,但是定量比较烦 elisa 可以直接读出浓度,但是如果抗体有非特异性结合,那得到的数值就不可信。 WB 只能半定量,但是可以检测细胞膜蛋白,这点 ELISA 做不到 ELISA 可用定量方法检测蛋白 ,也就是说可以观察不同浓度刺激物对目的蛋白的影响 WB 所检测的一般是抗原,而 Elisa 抗原抗体都可以检测。 WB 所检测的抗原可以知道其分子量的大小,或是否是多聚体、降解产物等,一句话,WB可以确定所用抗体是与那种蛋白起作用的;而 Elisa 无能为力,一锅端了。 WB 所适用的一抗一般是线性位点的,ELISA 线性或构象型抗体都可以使用。从另一个意义上讲,WB 可以做抗体是线性位点还是构象型位点的补充判定,而 Elisa 不行。WB 一次处理量就是一块胶版,10-20 个样品最多了。Elisa 一块 96 孔板一次可以处理 96 个样本,可以设置多个复孔、对照、梯度样等来提高检测的可信度。 WB 操作常见的非特异性条带,膜本底差,显色不好等等缺点在 Elisa 上表现得要好得多。 应用逆转录 PCR(PT-PCR)技术 RT-PCR。RT-PCR 为反转录 RCR 和实时 PCR 的共同缩写。是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在 RT-PCR 中,一条 RNA 链被逆转录成为互补 DNA,再以此为模板通过 PCR 进行 DNA 扩增。Western Blot Western Blot 中文一般称为蛋白质印迹。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克(George Stark) 。在尼尔·伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化学》 (Analytical Biochemistry)中首次被称为 Western Blot。原理Western Blot 与 Southern 印迹杂交或 Northern 杂交方法类似,但 Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质, “探针”是抗体, “显色”用标记的二抗。经过 PAGE 分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素膜 NC 膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。分类Western Blot 显色的方法主要有以下几种:i. 放射自显影ii. 底物化学发光 ECLiii. 底物荧光 ECFiv. 底物 DAB 呈色现常用的有底物化学发光 ECL 和底物 DAB 呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,目前发表文章通常是用底物化学发光 ECL。只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下(二抗用 HRP 标记):反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到 HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带。[编辑本段]其他值得一提的是,western blot 这个名称的由来很有意思。最开始做印迹工作的是一个叫做 So
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