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细胞免疫荧光的方法(自己实践记录).doc

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免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白,主要包括蛋白和一抗结合,其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗,荧光显微镜下即可观察到荧光,下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。zo-1 的免疫荧光,步骤如下:1、细胞在盖片上生长融合到 95%-100%时,从孵箱中取出。2、用预温的 1×PBS 洗 3 次,每次 10 分钟3、4% 的甲醛室温固定 20-30 分钟4、1×PBS 洗 3 次,每次 10 分钟5、0.2%Triton X-100 透化 2-5 分钟6、1×PBS 洗 3 次,每次 10 分钟7、5% BSA 室温封闭 30 分钟8、加一抗(用 1%BSA 稀释) 放在湿盒里, 4 度过夜9、1×PBS 洗 3 次,每次 10 分钟10、加二抗( 用 1%BSA 稀释)30 分钟,闭光!!!11、1×PBS 洗 3 次,每次 10 分钟12、95%甘油封片注:4%甲醛, 0.2%Triton,5%BSA 均用 1×PBS 稀释从大鼠分离的 T 细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致:1.取出细胞爬片放到 35mm 或 60mm 用过的细胞培养皿里,PBS 洗三遍。注意:有的时候作的细胞爬片可能比较小,因此夹取的时候要小心,注意 反正面,放在皿里洗比较方便,避免了来回夹取,另外洗的时候加 PBS 不要太冲,不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加 PBS,稍晃一下就倒掉,没有等 5 分钟或 10 分钟。2. 4%冷的多聚甲醛固定 20 分钟, PBS 洗三遍。3. 0.2%Triton X-100 通透 10 分钟,PBS 洗三遍。4. 与二抗相同宿主的血清封闭 30 分钟,PBS 洗三遍。5. 一抗 4 度湿盒内过夜,也可 37 度 2 小时,感觉前者效果好,PBS 洗三遍。6.二抗室温 2 小时(避光),或者 37 度 1 半小时,PBS 洗三遍。7.最好用 DAPI 染核,然后直接照荧光片。8.蒸馏水洗掉 PBS,甘油封片,指甲油封片子的四周,因为甘油不象树脂那样会干,所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。建议:1.还是染完之后没有封片前直接照一些,因为有的时候可能封片会出现问题,再想照反而没有了,另外不要拖太长时间,荧光会崔灭的。2.荧光的片子一定要避光保存,保存的好的话,过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心,不然有的时候有那种沉淀,在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点,非常难看。细胞免疫荧光简单实验步骤如下:1.漂洗血清蛋白 H7.2-7.4 37 度 PBS 2 小时.2.-20 度甲醇固定 20 分钟后,自然、干燥 10 分钟3.PBS 洗净:3min*34.1%Triton:25min-30min.配成 50ultriton+5mlpBS5.PBS 洗净:2*5min6.羊血清封闭:37 度,20 分钟7.一抗,4 度过夜,一般要大于 18 小时或者 37 度 1-2 小时8.4 度 PBS 洗净,3min*5 次9.二抗 37 度小于一小时10.37 度 PBS 洗净,3*5min凉干封片(封闭液 PH8.5)不管采用何种方法,在使用 PBS 缓冲液漂洗时,都要漂洗干净并且要测下 pH 值,可以使用 PBS 多清洗几次,也可以延长 PBS 清洗时间,如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。这是针对细胞爬片的免疫荧光染色标准步骤: 1)实验前一天,将细胞接入铺有 22×22mm(或 24×24mm)盖玻片的六孔板中。 2)第二天,待细胞汇合度达到 70%左右开始进行染色步骤。 3)用新鲜配制的 2%(或 4%)多聚甲醛固定细胞 10 分钟。 4)PBS 洗三遍,每次 5 分钟。 5)用 0.2-0.5% triton X-100 (PBS 配制)对细胞透化处理 10 分钟。 6)PBS 洗三遍,每次5 分钟。 7)2%BSA 或者 10%二抗同源血清(注意一定要是正常血清)封闭 30 分钟,PBS 洗两遍。8)加入 1 抗,室温孵育 1 小时。 9)PBS 洗三遍,每次 5 分钟。 10)加入二抗,室温孵育30-45 分钟。 11)PBS 洗四遍,每次 5 分钟。 12)加入 0.5 ug/ml DAPI(PBS 配制)染色 10 分钟(这里也可用其它的染核染料如hoechst 33258) 。 13)用 PBS 洗三遍,去除多余的 DAPI。 14)加入 20 ul 封片剂封片。 15)封片好的细胞样品可于 4 度冰箱中存放 2 周以上。 注意步骤 5-7 在某些蛋白的染色步骤中可能不是必须的,一抗如果有多种(但注意要是不同种属的)可以同时孵育,二抗同时使用时最好是同一种属来源(如驴抗兔,驴抗羊,驴抗鼠) ,以避免二抗间的交叉反应。 如果
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