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免疫组化各步原理.doc

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一、免疫组化技术 免疫组织化学(Immunohistochemistry; IHC) 技术是用标记的特异性抗体(或抗原)对组织内抗原(或抗体)的分布进行组织和细胞原位检测技术。目前,这种技术在临床病理诊断和形态学研究中已得到广泛应用。Slide 3:(一)、免疫组化常用染色 方法和步骤(石蜡切片) SP 法 (链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法) :SP 法 (链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法) 原理 采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。 主要步骤 :主要步骤 1、石蜡切片脱蜡 (与常规 HE 切片脱蜡相同):石蜡切片置 60 ℃烤箱烤片 15 小时以上→从烤箱中拿出立即放入二甲苯Ⅰ中 5~10 min→二甲苯Ⅱ 5~10min →无水乙醇 5min →95%乙醇 5min →80%乙醇 5min →70% 乙醇5min →自来水洗 Slide 6:2、3%H2O2 阻断 20min(以消除内源性过氧化物酶的活性,降低背景);PBS 洗 3 次,每次 5min。 3、抗原修复;PBS 洗 3 次,每次 5min。 4、滴加5~10%正常山羊血清封闭,37℃, 10min (消除背景非特异性着色) Slide 7:5、吸干组织周围多余的血清,不洗,滴加第一抗体,37℃, 孵育 60min 或孵育30min 再 4℃冰箱过夜;PBS 洗 3 次,每次 5min 。 6、擦干组织周围 PBS,滴加生物素标记的第二抗体,37 ℃, 孵育 20min, PBS 洗 3 次,每次 5min。 Slide 8:7、擦干组织周围 PBS,滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液 37℃, 孵育20min。 8、PBS 洗 3 次,每次 5min,D.W 洗 2 次,DAB 显色(DAB 必须现用现配),镜下控制显色程度, 自来水冲洗,苏木素复染胞核,烤干,中性树胶封片。 染色步骤 :染色步骤 石蜡切片脱蜡到水; 3%H2O2 阻断 10min(以消除内源性过氧化物酶的活性,降低背景);蒸馏水洗 2 次,PBS 洗 3 次,每次 5min。抗原修复;PBS 洗 3 次,每次 5min; Slide 11:滴加第一抗体,37℃孵育 60min 或 37℃孵育 30min 再 4℃冰箱过夜;PBS 洗3 次,每次 3min 。擦干组织周围 PBS,滴加酶标抗鼠 /兔聚合物,37℃, 孵育20min。 PBS 洗 3 次,每次 3min,D.W 洗 2 次,DAB 显色,镜下控制,自来水充分冲洗,复染,烤干,中性树胶封片。 (四)抗原修复 :(四)抗原修复 目的 : 1、 甲醛固定过程中形成醛键而封闭部分抗原决定簇;2、甲醛在保存过程中会形成羧甲基而封闭部分抗原决簇; 3、固定剂固定组织时,会使组织中蛋白与蛋白之间发生交联,也可能封闭抗原决定簇。 4、抗原决定簇被封闭之后,会影响抗原抗体的结合,因此在染色时需先进行抗原修复,通过抗原修复,充分暴露抗原决定簇。使抗原抗体得以充分结合。 Slide 15:抗原修复的作用机理是 1、抗原修复液中的化学物质分子或离子与部分抗原决定族结合产生化学反应,增加了细胞和组织的通透性,便于抗原抗体的充分结合。 2、高温可以使某些已封闭的抗原决定族得以重新暴露和修复。 3、微波是一种高频电磁波,可打开蛋白质之间的交联键,从而使抗原修复。 Slide 16:抗原修复注意事项 :抗原修复注意事项 1、应根据不同的抗原选择合适的修复方法。 2、热处理后应注意自然冷却,酶消化后要洗干净。 3、防止切片干燥,特别是热修复时要防止修复液蒸发而使切片干燥。 Slide 22:4、注意形态学结构的改变和脱片问题:酶消化浓度过高,时间过长、温度过高都可能导致组织的形态结构改变;热修复时间过长也可能导致形态学结构改变和脱片。 Slide 23:(五)常用溶液的配制 1、0.01MPBS: 磷酸二氢钠(NaH2PO4) 1.5g 磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O) 14.5g 氯化钠 42.5g 氢氧化钠 2 粒 加蒸馏水 5000ml Slide 24:2 、 3%H2O2 甲 醇 450ml 30%H2O2 50ml 混匀。 Slide 25:3、pH 值 6.0 的柠檬酸缓冲液 3.1 储存液: A 液:枸橼酸 21.01g 蒸馏水 1000ml B 液:枸橼酸钠 29.41g 蒸馏水 1000ml Slide 26:0.13.2 工作液: A 液 9ml B 液 41ml 蒸馏水 450ml 溶液 pH 值 为 6.0 Slide 27:4、胰蛋白酶 (0.05%~0.1% ) 取 0.05g 或 0.1g 胰蛋白酶加入到 100ml 0.1% pH7.8 的无水
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