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组织切片免疫组化-张.doc

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组织切片免疫组化-张.doc
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组织切片免疫组化雄鼠肾囊膜移植 ES cell 4-6 周处死小鼠,1%多聚甲醛固定 4℃保存(无限时) , 1. 脱水50%乙醇 30min 60%乙醇 30min 70%乙醇 过夜 80%乙醇 60min 90%乙醇 60min 95%乙醇① 20min 95%乙醇② 25min 100%乙醇① 20min 100%乙醇② 25min透明⑴ 以上每次移前快速用滤纸吸,但不能干,组织块轻夹,避免损伤,或者将组织快放在离心管中,依次加入不同浓度的乙醇,每次更换时,吸出大部分的乙醇,将剩余的连组织块倒在滤纸上,再立即反过来将组织块导入离心管,再加下一个浓度的乙醇)⑵ 液液之间误差约为 1min,进入后摇晃2. 透明 100%乙醇+苯(1:1)10min 苯① 过午 苯② 10min 浸蜡3. 浸蜡(62℃ 恒温箱,将组织块放在铁网中,挨个转移) 蜡①10min 蜡②20min 蜡③ 20min 4. 包埋:石蜡盒底部事先用手指涂点甘油,石蜡未凝固时将组织块拟切面朝下中间放置,盖上镂空塑料托,石蜡凝固后,自来水,完全冷却后,将包埋盒与塑料托分离,组织块应该留在托一边,收藏好等待切片(避尘)【蜡若凝固于组织块外围,将器皿搁酒精灯上烤烤,化后移入温箱】【组织块由苯移入蜡时,瓶边靠上即可,不用滤纸,在蜡之间移动组织块要快,尽量避免凝固】【用苯替代二甲苯透明可放置较长时间,组织块不易脆】5. 切片6. 展片,贴片卧式染缸+2/3 蒸馏水+10 滴蛋清甘油, 混匀;将蛋清甘油水溶液摸匀载玻片上,磨砂面朝上;将玻片在酒精灯火焰上晃 3-5 下(夏天)或 6-8 下(冬天)用手术刀取一段适宜长度的切片,移到载玻片液滴上,光面朝下;用展片针将皱的组织展开用手术刀分开组织片段,移于另一载玻片(事先蛋清甘油水溶液滋润)中间;组织方向尽量保持一致(根据形状,或有绒毛的朝上)置于片盘上,做好标记;移入恒温箱前,不能让切片干掉,要保持适度湿润(否则切片烤后不牢) ,但切片周围尽量不要留有蛋清甘油,以免染色后影响片子美观;移入 48℃恒温箱,烤片,过夜,2 天都行。7. 染色,封片1.脱蜡 二甲苯 ① 3min 二甲苯② 3min 100%乙醇 ① 5min 100%乙醇② 5min 95%乙醇① 5min 95%乙醇② 5min 90%乙醇 5min 80%乙醇 5min 70%乙醇 5min 自来水 3min 蒸馏水 3min 染色(或修复,抗体,显色,如果作免疫组化不能用脱过伊红的酒精去脱水)苏木精 7min(染色前将漂浮的氧化物用滤纸捞起,要慢放慢提,避免将沉淀悬浮起) 自来水漂洗5min(置盆中流水冲洗,水不能直接冲在玻片上) 酸酒精 浸提 N 次(4 次) (根据分色情况定)自来水漂洗 5min(回色) 漂洗前先用自来水洗一遍(漂洗后观察分色情况) 蒸馏水 3min 伊红 5min 若置于 90%酒精中褪色很快,往伊红中加 200ml 冰醋酸,搅匀,重复染色至深桃红(染色稳定后一般不再加冰醋酸) 70%乙醇 浸提 80%乙醇 浸提 90%乙醇 3min 95%乙醇① 5min 95%乙醇② 5min 100%乙醇① 5min 100%乙醇② 5min 二甲苯+100%乙醇(1:1) 3min 二甲苯①3min 二甲苯②3min (浸在二甲苯中,一片封完取另一片) 封片封片擦干二甲苯 中性树胶滴于组织边 盖玻片朝上一面酒精灯上晃一下(去水分) 盖玻片一边小心置于树胶液滴外沿 轻轻盖上(组织应在中间) 置片盘晾干(片盘晾干)【从脱蜡起直至封片,注意组织片均不能干】【看片时,若是苏木精颜色有点发黑,说明透明时组织干了】【看片时,若发现杂质,一要注意苏木精染色时要去氧化物,染色时要轻放轻取,二要在自来水漂洗前将水龙头包上棉花,纱布过滤】免疫组化:修复柠檬酸缓冲液放在烧杯中,置于水浴中,当柠檬酸缓冲液温度达到 95 度时,将玻片放入柠檬酸缓冲液中,当温度达到 92 度开始计时 92-98 度 30min,取出凉到室温,再将玻片取出, (柠檬酸缓冲液只能使用一次) ,我放置了 2.5hr 才取出。然后蒸馏水洗, PBS 洗 5min,3 次,最后一次时间可长,1 擦去玻片周围的水,放置在湿盒中,加 B 液,盖上湿盒;2 再取另一片重复上一步,大约 9 片后计时 15min;然后全部结束;3.时间到后,从第一片开始取出玻片用蒸馏水冲洗 2-3 次,放入浸在 PBS 的架子上,继续另一片;4.全部结束后计时 5min,3 次,期间提起架子混匀液体 ;5.最后一次洗涤时间到后,取出按照 1 和 2 的步骤加一抗,和空缺一抗对照;【注意放置一抗过夜时一定要放平湿盒,保证液滴不流,否则标本会干】6.重复 3 和 4 步7 重复 5 加 A 液8 重复 69 重复 5
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