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免疫比浊法工艺模板.docx

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纤维蛋白(原)降解产物测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)主要生产工艺及反应体系的研究一、 实验目的研究合适的纤维蛋白(原)降解产物的生产工艺和最佳反应体系。二、 实验设计思想纤维蛋白(原)降解产物测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)原理是样本中的 FDP 抗原与试剂中的抗体结合,形成抗原抗体复合物,产生吸光度变化,胶乳试剂可特异性的增大该吸光度的变化,增大试剂的灵敏度。该吸光度变化的高低与样本中的 FDP 的含量成正比,测定该吸光度,采用与校准品比较,即能得出样本 FDP 的含量。三、 主要仪器及试剂材料1. D240 全自动生化分析仪/ 雷杜 420 全自动生化分析仪生产商:南京神州英诺华医疗科技有限公司/深圳雷杜生命科学股份有限公司2. 纤维蛋白(原)降解产物校准品FDP 含量:84μg/mL生产商:上海捷门生物技术合作公司批号:S2814-1四、 实验内容及程序纤维蛋白(原)降解产物测定试剂盒主要生产工艺过程的研制及试剂盒反应体系的建立分为三个部分:生产工艺的研制、试剂盒组成的研制、试剂盒反应体系的建立。产品拟定标准:线性范围:在拟定线性范围内,相关系数 r≥0.99;准确度:测定已知溯源的 FDP 质控品,相对偏差(Bias%)≤±25%;灵敏度:测定已知溯源的 FDP 质控品 12 次,结果 CV≤20%;精密度:测定已知溯源的 FDP 质控品 20 次,结果 CV≤15%。1. 主要工艺描述1.1 原液的准备购进商品化的高效价纤维蛋白(原)降解产物抗体致敏胶乳,将其稀释成合适的倍数,作为试剂 2 备用。选择合适的缓冲体系,加入一定量的增浊剂和稳定剂作为试剂 1 备用。1.2 原液的验证购进有溯源的定值校准品,在生化分析仪上,将适量的校准品加入试剂 1 中,在适宜的条件下,和试剂 2 反应,根据校准品浓度和吸光度做剂量/ 响应曲线,得出一条持续上升的平滑曲线,即得到合格的原液。2. 反应体系的组成及其研究2.1 购进有溯源并标示有定值的校准品;FDP 含量:84μg/ml生产商:上海捷门生物技术合作有限公司批号:?2.2 致敏胶乳的准备抗体致敏胶乳:上海捷门生物技术合作有限公司提供用实验室 PBS 缓冲液(0.1mol/L,PH=7.4 )将其倍半稀释,分别稀释成:3.5 倍、3 倍 2.5 倍、2 倍、1.5 倍。用上述已准备好的不同稀释倍数 FDP 抗体致敏胶乳和稀释好的校准品在生化仪上进行操作。2.2.1 实验方法空白管(B) 标准管(S) 样品管(U)蒸馏水(μL)5校准品 5样本 5试剂 1 225 225 225混匀,37℃孵育 3-5min试剂 2 75 75 75混匀,37℃孵育 10 秒后,读取吸光度值 A0,孵育 5 分钟后,读取吸光度值 A1,计算△A=A1-A02.2.2 实验结果校准品浓度(μg/mL)稀释倍数 5.25 10.5 21.0 42.0 84.03.532.522.2.3 实验结论由上述测试结果可以看出,将 FDP 抗体致敏胶乳稀释到?倍的时候高值出现下滑,因此本试剂的最高稀释倍数为?倍, 因此购进上海捷门生物技术合作公司的 FDP 抗体致敏胶乳,选择能够稀释 ?倍或以下倍数的致敏胶乳原料。2.3 缓冲体系的选择由于致敏胶乳的稀释是 PBS 缓冲液,因此反应的缓冲体系也选用相同浓度和 PH 值的缓冲液2.3.1 PH 值的选择经过纯化的抗体在常用的缓冲液中是稳定的,PH 值应保持在中性左右。PH 在 7 到 8 之间时,保存多年,对抗体也无实质性的损害,可保证其活性的稳定性。配制 PH 值分别为: 7.0、7.4、7.8 、8.0 的 PBS 缓冲液,选择稀释了?倍的致敏胶乳抗体作为试剂 2。按照 2.2.1 中的实验方法进行操作。2.3.1.1 实验结果校准品浓度(μg/ mL)PH 值5.25 10.5 21.0 42.0 84.07.07.47.88.02.3.1.2 实验结论由测试结果可以看出 PH 在 7.4 的时候线性是最好的,而且各相邻浓度之间吸光度变化明显,因此可以确定 PH 为 7.4 时,是最佳的反应环境。2.3.2 稳定剂的选择叠氮钠价格低廉,原材供应渠道广,是实验室常用的稳定剂,用量很少。因此选用叠氮钠 1g/L。2.3.3 PEG 浓度PEG 有促进抗原抗体结合的作用,很多时候抗原抗体反应缓慢,为了满足临床检测的需求会加入适当的 PEG 加快抗原抗体反应速度,缩短检测时间。配制 PEG 浓度:0%、0.5%、1%、1.5%、2%的 PBS 缓冲液,并将配制好的缓冲液作为试剂 1 备用。选择稀释了 3 倍的致敏胶乳作为试剂 2,按 2.2.1 方法操作。2.3.3.1 实验结果校准品浓度(μg/ mL)PEG(%)5.25 10.5 21.0 42.0 84.
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