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免疫组化方法和步骤.doc

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威斯腾生物 400-675-6758免疫组化检测 CD34+的表达 1 基本原理免疫组化,是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质) ,对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。威斯腾生物 400-675-6758(1)1×PBS(pH 7.4,2.5L=20.0157g 137mM NaCl+0.499552g 2.68mM KCl+0.50013075g 1.47mM KH2PO4+7.253337g 8.1mM Na2HPO4) ,115℃×15 min;(2)0.85%NaCl 500 ml=4.25 g Nacl+500 ml 三蒸水,115 ℃×15 min;(3)4%多聚甲醛 500 ml=20 g 多聚甲醛+500 ml PBS 在 65 ℃水箱中 3 h 多,再放入4 ℃保存。(4)DNase I buffer:40 mM Tris-HCl (pH 7.9)+10 mM NaCl+6 mM MgCl2+10 mM CaCl2;(5)Proteinase K buffer:100 mM Tris-HCl (pH 8.0)+50 mM EDTA;(6)DNase 1(原液 1000 U/ml 按 1:99DNase 1 缓冲液稀释至 10 U/ml) ;(7)DAB 工作液(临用前配制,5ul 20×DAB+1ul 30%H2O2+94 ul PBS)(8)20 μg/ml Proteinase K 工作液(按 1:500 稀释贮存液 1 mg/ml) 。威斯腾生物 400-675-6758(9)另外,双蒸水、无菌 0.85%NaCl、二甲苯、梯度乙醇(100、95、85、70、50%) 、苏木素。2 主要仪器设备电热压力蒸汽消毒器(XDD) 浙江绍兴医疗器械总厂超净工作台 苏州净化设备公司TC2323 型 CO2恒温孵箱 美国 SHEL LAB 公司恒温烤箱 上海跃进医疗器械厂高速台式离心机(BACKMAN CS-15R) 美国 Beckman 公司抽滤器( AUTOSCIENCE AP-01) 上海磁力搅拌器(79-1) 江苏江阴科研器械厂0.22um 纤维素滤膜 德国 BM 公司0.45um 混合纤维素滤膜 德国 BM 公司1/10000 电子天枰(Sartorius AC-211) 德国细胞培养瓶及细胞培养板(Costar) 美国细胞计数板 上海医用仪器厂光学显微镜(OLYMPUS CK-40) 日本倒置显微镜(OLYMPUS) 日本照像系统(OLYMPUS BH-2) 日本切片机: 德国 Leica展片机: 德国 Leica,HI1210 型烤片机: 德国 Leica,HI1220 型3 实验方法3.1 载玻片的处理:抗原修复过程中,由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响,极易造成脱片。1. APES:现用现配。将洗净的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀释的 APES 中,停留 20~30 秒钟,取出稍停片刻,再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的 APES,置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位,并尽量减少气泡的存在,以免影响染色结果。2. HistogripTM:将洗净的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀释的 Histogrip 液中,停留 1~2 分钟,威斯腾生物 400-675-6758然后用双蒸水快速清洗三次,室温干燥或 60oC 烤箱烘烤一小时,装盒备用。3. Poly-L-Lysine:将洗净、干燥的载玻片放入以 1:10 比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中,浸泡 5 分钟,60oC 烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。3.2 常用酶消化:1) 胰蛋白酶:一般使用浓度为 0.05%~0.1%,消化时间为 37℃、10~40 分钟,主要用于细胞内抗原的显示。2) 胃蛋白酶:一般使用浓度为 0.4%,消化时间为 37℃ 、30~180 分钟,主要用于细胞间质抗原的显示,如:Laminin(层粘蛋白) ,Collagen IV(IV 型胶原)等。3)皂素(Saponin):一般使用浓度为 2~10 g/ml 的 saponin 溶液,消化时间为室温孵育 30分钟。3.3 抗原热修复可根据实验室的具体条件,选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修
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