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免疫组化操作步骤.docx

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免疫组化操作流程试剂准备1. PBS缓冲液(pH7.2 ~7.4): NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3mmol/L,KH2PO4 1.4mmol/L。2. 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB,pH6.0,1000ml):柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g。即抗原修复液3.PBST: PBS+吐温-20(1000:1)洗液可全部运用 PBST4. 3% 甲醇-H2O2 溶液:用 30%H2O2和 80%甲醇溶液配制。5. 封片剂:中性树脂+二甲苯。操作流程免疫组织化学染色SP法:1. 脱蜡、水化: 脱蜡前,应将切片在 60℃恒温箱中烘烤 60~120分钟,观察石蜡应溶解。从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡 30分钟,更换二甲苯后再浸泡 30分钟;无水乙醇中浸泡 3分钟;95%乙醇中浸泡 3分钟;70%乙醇中浸泡 3分钟(我用 80%) ;50%乙醇中浸泡 3分钟;自来水中浸泡 3分钟;梯度脱蜡2. 抗原修复:(用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片)高压热修复 高压锅里放少许水,用一量杯或容器(大小能容纳玻片架为宜)装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸,再放入玻片架,盖上不锈钢高压锅的盖子,将排气阀门套上,待听到阀门冒气时,即可倒计时 2min,之后将玻片杯一起放入凉水中,静置 15min,平衡至室温。电磁炉 1000W 2min。3.丢弃抗原修复液,将玻片浸泡在去离子水中(时间不限)可省略4.用组织笔沿组织边缘画线(可与组织边缘留适当间隙) ,画完立即放入 PBST溶液中浸泡 3遍 X3min(三个容器,每个容器 3min,时间不限制) 。5. 3%H2O2滴加在切片上,室温静置 15分钟(3%的 H2O2用 30%的H2O2加双蒸水稀释 10倍,现配现用。目的为阻断内源性过氧化物酶);6. PBST洗 3次各 3分钟(过三缸)7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温 30分钟。用与一抗不同源的血清即可,本人用 Western-blotting的含胎牛血清封闭液。8. 甩去封闭液(注:不要冲洗) ,滴加一抗 50ul(至少 50ul否则易干片) ,4℃孵育过夜。4℃过夜后需在 37℃复温 45分钟(未验证:室温静置 1小时或者 4℃过夜或者 37℃1 小时。 ) 。9. PBST洗 3次各 3分钟;10. 滴加兔或鼠二抗一滴,先滴辅助剂,再滴二抗,之间用 PBST洗三次,每次 3min,每次室温各静置 15分钟;所用试剂盒为中杉金桥的超敏二步法免疫组化检测试剂。11. PBST洗 3次各 3分钟;12. DAB显色几秒至几分钟,在显微镜下掌握染色程度;DAB 为福州迈新试剂,先配现用。13. PBST或自来水冲洗 10分钟;14. 苏木精复染 20秒,自来水分化;15.自来水冲洗 30分钟;16. 酒精梯度脱水(酒精浓度从低到高,每缸浸泡数秒即可) 、透明、封片、镜检。
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