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荧光免疫标本.doc

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(3333) 免疫荧光免疫荧光免疫荧光免疫荧光 1.标本准备标本准备标本准备标本准备 解剖出的脑组织经 4%多聚甲醛固定过夜,依次用 15%、30%蔗糖脱水, 各 10-24 小时。将标本沿中线切开,去除多余部分,保留皮层,然后用 OCT 包埋剂包埋,液氮中速冻 1 分钟,用病冻切片机制做皮层的矢状面切片,切片厚度为 10µm,切片于 40°C 烤箱中烤 24-48 小时,然后进行下一步的染色过程。 2.免疫荧光染色免疫荧光染色免疫荧光染色免疫荧光染色 (1) 切片:组织冰冻切片准备如上一步。如果是细胞标本则预先将细胞种植在多聚赖氨酸及纤粘连蛋白包被的玻璃片上,染色前 4%多聚甲醛固定 20min,0.1 M PBS 洗涤 3 次。(2) 通透:0.5%Triton X-100 室温通透 20 分钟,0.1 M PBS 洗涤 3 次(对于核染色的抗体如 Sox2 可适当延长通透时间,而对于膜染色的则不通透),EGFR 染色以 5-10 分钟为佳。 (3) 封闭:正常羊血清工作液或 10%BSA 室温封闭 1 小时。 (4) 一抗:用抗体稀释液稀释一级抗体后,4℃ 过夜。0.1 M PBS 洗涤 3 次。 (5) 二抗:选择相应的二抗,用 3%牛血清白蛋白稀释,室温孵育 1 小时。0.1 M PBS 洗涤 3 次。 (6) 封片:滴加荧光防淬灭封片剂封片。 (7) 观察照相:在荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜下观察照相。 免疫荧光技术原理及标本的制备、固定与保存优尔生门户网站 www.uscnk.cn 2009-9-13 7:10:35 作者:优尔生免疫荧光技术原理及标本的制备、固定与保存一、 原理亦称荧光抗体技术,应用化学方法将荧光色素(主要是异硫氰酸荧光黄,fluorescein isoth iocyanate,FITC)与抗体结合起来,即荧光抗体,这种结合荧光色素的抗体的免疫原性并不因此而发生改变,在特定条件下用其着染标本,如果标本中存在有相应的抗原,荧光抗体便与标本中的抗原发生特异性结合,在荧光显微镜的蓝紫光或紫外光照射下,标本中的抗原抗体复合物便发出特异的荧光,荧光的出现表明被检标本中特异抗原的存在;如果标本中不存在相应抗原,两者便不能结合,水洗时,荧光抗体便被洗掉,因而标本在荧光显微镜下观察不呈现特异荧光。因此,可以根据荧光的有无及强弱来判定抗原与抗体是否存在或相对应。二、 标本的制备、固定与保存(一 ) 标本制备标本的制备应力求保持抗原的完整性,并在染色、洗涤及固定过程中不发生溶解或变性,也不会扩散到邻近细胞或组织间隙中去。此外,为了便于抗原和抗体接触,形成抗原抗体复合物,以及有利于观察和记录,要求制备的标本尽量薄,对标本中干扰抗原抗体反应的物质应充分洗涤除去,以免影响标本的观察及结果的判定。1. 病料等标本在一般诊断工作中最常用,适用于检查细菌培养物、血液、脓汁、粪便、尿沉渣、穿刺液以及感染动物的脏器和病变组织等,均可以做成涂片或压印片标本。(1) 涂片方法:先将玻片通过火焰3次,冷却后,以白金耳挑选被检材料均匀涂布成约1cm 的圆形涂片。如材料太浓,则应预先加适量灭菌生理盐水于另一玻片上,用白金耳取材料与其混合稀释,待均匀后涂片,也可将生理盐水加入被检材料中,混合均匀后涂片。涂好后,晾干或以电风扇吹干备用。(2) 压印片方法:用无菌剪子将待检组织剪开,用无菌的清洁干净棉球或滤纸将切面的血液吸干,然后以玻片轻压切面,使之沾上1~2层细胞,然后再在玻片另一处以切面涂拭,得一较厚抹片,面积按需要而定,标本晾干或吹干。对于容易脱落的材料,如炭疽杆菌等的液体培养物或钩端螺旋体等,在压片之前,载玻片上应加入适量的粘稠物(如2%~5% 蛋清等),以防压印的标本脱落。2. 组织培养标本利用免疫荧光技术研究病毒时,多用组织培养的细胞。较好的方法是在方瓶或雷顿瓶内放半片盖玻片,培养的细胞在其上生长成单层以供使用。培养的细胞一般比组织中的细胞大而薄,适用于观察细胞内特异性抗原的详细分布情况,因为能分辨出在核内或在细胞质内的抗原。特别是研究病毒在细胞内的繁殖情况时,用这种方法制备的标本比其它方法好。(二 ) 标本的固定被检标本的固定是免疫荧光技术中的重要环节,往往对荧光染色效果表现明显的影响。如所用固定条件不同,荧光抗体染色的抗原在细胞内的分布和形态就会发生变化。所以,当解释染色效果时,要注意固定条件的影响。除了研究细胞表面抗原可不固定外,一般均应先固定,然后进行荧光抗体染色。固定的目的及原则(1) 固定的目的: ①防止被检材料从玻片上脱落;② 清除阻止抗原抗体结合的类脂,使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果;③固定的标本易于保存,如组织切片标本固定后,在-20℃下可保存一年,而不改变其染色性。(2) 固定的原则: ①不损
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