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免疫转印法.doc

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Western Transfer and Immunostaining生物化學實驗 S2-1S2 免疫轉印法莊 榮 輝膠體電泳 可以把蛋白質依照分子量大小分開,若膠體內的蛋白質色帶能轉印到尼龍膜,則這些蛋白質可繼續以其專一性抗體來偵測,成為更強大的解析工具。2.1 背景知識膠體電泳的原理與前面 P3 實驗完全一樣,而蛋白質轉印也是相同的機制,只是轉個方向,把膠片上的色帶印到尼龍膜。2.1.1 蛋白質轉印膠體電泳的解析力雖然很高,可以把複雜的蛋白質混合物分離開來,但是不能方便地鑑別這些色帶的身分;原因之一,是因為膠體本身易脆,不容易進一步操作,因此要先把這些色帶轉移到尼龍薄膜上,再繼續以其它方法檢定之;而最常用的方法,便是以抗體對尼龍膜上的蛋白質色帶進行免疫偵測。圖 S2-1 蛋白質轉印及免疫染色的原理機制B三 三三三ComasieBluSting三三PonceauStig三三三三三三三A三三三+Filter Papr-GelNitroclus三三三三 E免疫轉印法 S2S2-2 Biochemistry Laboratory早期蛋白質轉印法是使用 硝化纖維紙 (nitrocellulose),蛋白質可吸附在紙上的硝基,不易脫落。後來改用尼龍材質的薄膜 (如 PVDF),上面有各種修飾基團,可強力地吸引住蛋白質,但降低非專一性的吸附,使結果更為可靠。轉印膜在轉印後的空白部份,通常都要以無關的蛋白質覆蓋起來,以免後面操作所用到的抗體等物質,吸附到轉印膜上去。通常都使用脫脂奶粉,我們則比較常用明膠,隨人喜好而定。轉印時,要小心分子量較小的蛋白質,可能會穿過轉印膜而損失;可在轉印緩衝液中添加甲醇 (10~30%),以增加轉印膜對蛋白質的吸附力量。反之,也有商品標榜在一次轉印後,可以同時印出十張相同的轉印膜,減少膠片消耗與轉印時間;這在蛋白質體學的應用上,有相當大的吸引力,因為同一張二次元電泳的轉印膜,可能要進行很多種不同的偵測反應,因此需要很多張相同的轉印膜。另外,注意有些在轉印以後要分離色點,然後進行胺基酸定序,若是使用Edman degradation 反應的定序儀,則轉印緩衝液中避免使用帶有-NH 2 基團的成份 (如 Tris, Gly),以免干擾 Edman degradation。有時候,可以把酵素轉印到膜上,然後直接在上面進行催化反應,若能產生不溶性的生成物,原地凝集在轉印膜上,則可做為酵素的檢定之用。例如磷酸脢 (phosphatase) 或過氧化氫脢 (peroxidase),都可直接在轉印後呈色。當然,若使用 SDS 膠體電泳,則必須在轉印後,使酵素充分回復原態及活性。2.1.2 免疫染色膠體電泳的高解析力,加上抗體的高專一性,結合成為一個極為強大的分析工具。因此,一直到目前,電泳轉印加上免疫染色的流程,都是所有生物科技相關實驗室所必備。一次抗體有時可以買到商品,但通常都極為昂貴;較不常見的抗原,則必須自行製備抗體,那就要先準備好純質抗原。 抗原與佐劑 (adjuvant) 混合成乳劑後,進行動物免疫,通常使用大白兔或小白鼠。每兩週免疫一次,如此進行追加免疫約四到六次,試採血檢測血清效價,若血清稀釋 1,000 到 10,000 倍,仍然可在轉印膜上染出抗原的色帶,則免疫可謂成功,即可進行採血,製得抗血清,其中即含有所要的專一性抗體。專一性抗體會像『巡弋飛彈』一樣,自動去找出抗原色帶,並且與此色帶緊密結合,然後再利用 二次抗體 (即第一次所用抗體的抗體,可以買到 ) 與上述抗體結合。 圖 S2-2 說明此一設計,抗體上面標有 2 者即為二次抗體,後面連結著標誌酵素 (E);標誌酵素多使用上述的磷酸脢或者過氧化氫脢,兩者在加入基質後,都可生成具有強烈呈色的沈澱。免疫轉印法 S2生物化學實驗 S2-3使用二次抗體與酵素的連結體,雖然增多一次操作動作,但也提升了整個反應的專一性,因為多加一次專一性篩選步驟,而且自由的一次抗體效價較高。同時也較方便,因為各種一次抗體都可直接使用,然後用二次抗體與酵素連結體即可,不須各種一次抗體都得去做酵素標誌。2.1.3 實驗大綱本實驗分成三個部份︰(1) SDS-PAGE 膠體電泳、(2) 蛋白質轉印、(3) 免疫染色。樣本為前面實驗的 trypsin 及胰臟抽取液,並使用 CHOM 為負對照組,然後以抗 trypsin 的抗體為探針,進行專一性的偵測。圖 S2-3 蛋白質轉印及免疫染色操作流程E2圖 S2-2 免疫染色的設計轉印膜不相關蛋白質一次抗體二次抗體酵素連結免疫轉印法 S2S2-4 Biochemistry Laboratory2.2 膠體電泳兩組鑄造兩片平板 SDS 電泳膠片,分別進行各組 trypsin 樣本的分析,接著並進行蛋白質轉印,則請依照下節 2.3 實驗步驟操作。
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