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免疫学寄生虫.doc

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1第五篇 实验技术及抗寄生虫药物第十七章 寄生虫病原检查技术寄生虫学诊断技术包括病原检查、免疫学检查和分子生物学检查等三个方面。本节将主要对病原检查的各种技术方法作一较全面的介绍第一节 粪便检查粪便检查是诊断寄生虫病常用的病原学检测方法。要取得准确的结果,粪便必须新鲜,送检时间一般不宜超过 24 小时。如检查肠内原虫滋养体,最好立即检查,或暂时保存在 35°C~37°C 条件下待查。盛粪便的容器须洁净、干燥,并防止污染;粪便不可混入尿液及其它体液等,以免影响检查结果。具体方法如下:(一)直接涂片法(direct smear method) 用以检查蠕虫卵、原虫的包囊和滋养体。方法简便,连续作 3次涂片,可以提高检出率。1.蠕虫卵检查 滴一滴生理盐水于洁净的载玻片上,用棉签棍或牙签挑取绿豆大小的粪便块,在生理盐水中涂抹均匀;涂片的厚2度以透过玻片隐约可辨认书上的字迹为宜。一般在低倍镜下检查,如用高倍镜观察,需加盖片。应注意虫卵与粪便中的异物鉴别。虫卵都具有一定形状和大小;卵壳表面光滑整齐,具固有的色泽;卵内含卵细胞或幼虫。2.原虫检查(1) 活滋养体检查:涂片应较薄,方法同查蠕虫卵。气温愈接近体温,滋养体的活动愈明显。必要时可用保温台保持温度。(2)包囊的碘液染色检查:直接涂片方法同上,以一滴碘液代替生理盐水,粪便涂抹方法同上。若同时需检查活滋养体,可在玻片另一侧滴一滴生理盐水。同上法涂抹粪便标本,再盖上盖片。片中滴碘液的一侧查包囊;另一侧查活滋养体。碘液配方:碘化钾 4g,碘 2g,蒸馏水 100ml。(3)隐孢子虫卵囊染色检查:目前最佳的方法为金安-酚改良抗酸染色法。其次为金胺酚染色法和改良抗酸染色法。对于新鲜粪便或经 10%福尔马林固定保存(4℃1 个月内)的含卵囊粪便都可用这三种方法染色。染色过程是先用金胺-酚染色,再用改良抗酸染色法复染。方法步骤如下:金胺-酚(auramine-phenol)染色法:1)染液配制:1g/l 金胺—酚染色液(第一液):金胺 0.1g,石炭酸 5.0g,蒸馏水 100ml;3%盐酸酒精(第二液):盐酸 3ml,95%3酒精 100ml;5g/l 高锰酸钾液(第三液):高锰酸钾 0.5g,蒸馏水100ml。2)染色步骤:滴加第一液于晾干的粪膜上,10~15 分钟后水洗;滴加第二液,1 分钟后水洗;滴加第三液,1 分钟后水洗,待干;置荧光显微镜检查。低倍荧光镜下,可见卵囊为一圆形小亮点,发出乳白色荧光。高倍镜下卵囊呈乳白或略带绿色,卵囊壁为一薄层,多数卵囊周围深染,中央淡染,呈环状,核深染结构偏位,有些卵囊全部为深染。但有些标本可出现非特异的荧光颗粒,应注意鉴别。改良抗酸(modified acid-fast method)染色法:1)染色液配制:石炭酸复红染色液(第一液):碱性复红4g,95%酒精 20ml,石炭酸 8ml,蒸馏水 100ml;10%硫酸溶液(第二液):纯硫酸 10ml,蒸馏水 90ml(边搅拌边将硫酸徐徐倾入水中) ;20g/l孔雀绿液(第三液):20g/l 孔雀绿原液 1ml,蒸馏水 10ml。2)染色步骤:滴加第一液于晾干的粪膜上,1.5~10 分钟后水洗;滴加第二液,1~10 分钟后水洗;滴加第三液,1 分钟后水洗,待干;置显微镜下观察。经染色后,卵囊呈玫瑰红色,圆形或椭圆形,背景为绿色。如染色(1.5 分钟)和脱色(2 分钟)时间短,卵囊内子孢子边界不明4显;如染色时间长(5~10 分钟)脱色时间需相应延长,子孢子边界明显。卵囊内子孢子均染为玫瑰红色,子孢子呈月牙形,共 4 个。其他非特异颗粒则染成蓝黑色,容易与卵囊区分。不具备荧光镜的实验室,亦可用本方法先染色,然后在光镜低、高倍下过筛检查。如发现小红点再用油镜观察的效果好,可提高检出速度和准确性。金胺-酚染色-改良抗酸复染法用本法可克服上述染色法的缺点。具体方法是:先用金胺酚染色后,再用改良抗酸染色法复染。再用光学显微镜观察,卵囊同抗酸染色法所见,但非特异性颗粒被染成兰黑色,两者颜色截然不同,极易鉴别,使检出率和准确性大大提高。(二)厚涂片透明法(改良加藤法) (modified Kato’s thick smear)厚涂片透明法适于蠕虫卵检查。取约 50mg(已用 100 目不锈钢筛除去粪渣)粪便,置于载玻片上,覆以浸透甘油 —孔雀绿溶液的玻璃纸片,轻压,使粪便铺开(20×25mm) 。置于 30~36℃温箱中约半小时或 25℃约 1 小时。待粪膜稍干,即可镜检。玻璃纸准备:将玻璃纸剪成 22×30mm 大小的小片,浸于甘油—孔雀绿溶液(含纯甘油 100ml、水 100ml 和 1ml 3%孔雀绿水溶液)中至少浸泡 24 小时,至玻璃纸呈现绿色。5使用此法需掌握粪膜的合适厚度和透明的时间,如粪膜厚透明时间短,
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