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免疫组化SABC法与SV法的比较.docx

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博士德免疫组化 SABC 法与 SV 法的比较发布时间:2011-12-08 22:38 点击次数: 186 免疫组化 SABC 法与 SV 法的比较 SABC 法:ABC 代表的是亲和素-生物素-过氧化物酶复合物。利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗和生物素标记的酶。SABC(链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物)就是 StreptAvidin Biotin Complex 的英文缩写。这一方法集中体现了目前最先进的免疫组化所必必具备的高敏感性、特异性及操作快速、简便的所有特征。基本原理:亲和素(Avidin)存在于鸡蛋中,分子量 67000。是一种碱性蛋白质,具有对生物素近乎于共价键的结合力。链霉亲和素是一种从链霉菌(Streptomyces Avidinii)培养物中所提取的蛋白质,分子量 47000,不含糖链,等电点 IP=6.0-6.5。和亲和素一样,也有四个生物素结合位点,亲和力高达 10-15M。和亲和素相比,链霉亲和素更为完美。现在经过改进的亲和素等电点 IP 可以达到 7.0,明显地消除了原碱性蛋白特征所引起的非特异性吸附。生物素是一种水溶性维生素(即维生素 H),分子量 244。生物素活化后,可以标记抗体和酶而不影响其活性。链霉亲和素—酶复合物可以起到放大信号的作用,这是 SABC 具有高度敏感性的基础。SV(Super Vision)两步法:是用聚合标记方法将过氧化物酶连接到二抗上,形成类似于章鱼的超大分子抗体- 酶聚合物,替代传统方法中的二抗和三抗。这种聚合物拥有强大的信号放大能力,同时有很强的组织细胞渗透力,经检测其灵敏度高于同类产品,特别是针对核抗原,其渗透性特别强,适合免疫组化的应用。此系列检测试剂与传统的三步法比较具有简单,快速,高敏感,低背景等特点。原理示意图:用聚合标记方法将过氧化物酶连接到二抗上,形成类似于章鱼的超大分子抗体-酶聚合物现对这两种方法进行比较:一.材料所选试剂:即用型 SABC(过氧化物酶)试剂盒(博士德货号 SA1021,SA1022)即用型 SV(HRP 辣根过氧化物酶)试剂盒(博士德货号 SV0001,SV0002 )DAB(黄色,博士德货号 AR1022)Mayor`s 苏木素(博士德货号 AR0005)所选一抗:KCA3.1(BA1788); PCNA(BM0104 ); Vimentin( BM0135)注:抗体来源均为博士德公司所选组织片:乳腺癌石蜡切片,肠癌石蜡切片,切片厚度为 5 微米二.操作步骤SABC 法:1.切片脱蜡至水2.新鲜配置 3%H2O2,室温 10 分钟, 灭活内源性酶,然后用蒸馏水冲洗 2 分钟三次3.微波修复:将切片放入盛有 PBS 缓冲液(PH7.2-7.6)的杯子中,在微波炉里加热煮沸,微波炉中静置5分钟,拿出室温冷却6分钟,再微波续热至沸腾后完全室温冷却4.滴加 5%BSA 封闭液,37℃反应 30 分钟。甩去多余液体 ,不洗5.滴加一抗,4℃反应过夜。所配一抗的浓度为 1µg/ml6.PBS 缓冲液(PH7.2-7.6)洗 10分钟×3 次,滴加生物素化二抗 IgG(抗兔或抗鼠)37 ℃反应 30 分钟7.PBS 缓冲液(PH7.2-7.6)洗 10分钟×3 次,滴加试剂 SABC,37 ℃反应 30 分钟,PBS 洗 30分钟×3 次8. DAB 室温显色,镜下控制反应时间,蒸馏水洗涤9. 滴加苏木素轻度复染 60 秒,蒸馏水洗涤后浸入饱和 Na2HPO4 溶液中 2 分钟,取出后洗涤,37℃恒温箱干燥过夜,中性树胶封片。SV 法:1.切片脱蜡至水2.新鲜配置 3%H2O2,室温 10 分钟,灭活内源性酶,然后用蒸馏水冲洗 2 分钟三次3.微波修复:将切片放入盛有 PBS 缓冲液(PH7.2-7.6)的杯子中,在微波炉里加热煮沸,微波炉中静置5分钟,拿出室温冷却6分钟,再微波续热至沸腾后完全室温冷却4.滴加 5%BSA 封闭液,37℃ 反应 30 分钟。甩去多余液体,不洗5.滴加一抗,4℃反应过夜,所配一抗的浓度为 1µg/ml6.PBS 缓冲液(PH7.2-7.6)洗 10分钟×3 次,滴加 HRP 标记二抗 IgG (抗兔或抗鼠)37℃反应 30 分钟,PBS 缓冲液(PH7.2-7.6)洗 30 分钟×3 次7.DAB 室温显色,镜下控制反应时间 ,蒸馏水洗涤8. 滴加苏木素轻度复染 60 秒,蒸馏水洗涤后浸入饱和 Na2HPO4 溶液中 2 分钟,取出后洗涤,37℃恒温箱干燥过夜,中性树胶封片。三.结果比较四.结论SABC 法的特点:1.稳定性好:链酶亲和素结合生物素的亲和常数是抗原结合抗体反应的百万倍,二者结合形成复合物的解离常数很小。因此,SABC 法在实际应用中,稳定性高,减少了操作误差,提高了检测的精确度2.特异性
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