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免疫组化相关步骤.doc

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免疫组化操作步骤(一) 、仪器设备1. 18cm 不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅(二) 、试 剂1. PBS 缓冲液(ph7.2―7.4):NaC137mmol/L,KCl 2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L.2.0.01mol/L 柠檬酸钠缓冲液(CB,ph6.0,1000ml):柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g。3.0.5mol/L EDTA 缓冲液(ph8.0):700ml 水中溶解 186.1g EDTA2H2O,用 10mmol/L NaOH 调至 ph8.0,加水至 1000ml.4. 1mol/L 的 TBS 缓冲液(ph8.0):在 800ml 水中溶解 121gTris 碱,用 1N 的 HCl 调至 ph8.0, 加水 1000ml。5. 酶消化液:a. 0.1%胰蛋白酶:用 0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液: 用 0.1N 的 HCl 配制。6. 3%甲醇―H2O2 溶液:用 30%H2O2 和 80%甲醇溶液配制7.风裱剂:a. 甘油和 0.5mmol/L 碳酸盐缓冲液(ph9.0–9.5)等量混合 b 油和 TBS(PBS)配制8.TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本 ;ph7.0-7.4 适合光学纤维标本(三) 、操作流程1、脱蜡和水化:脱蜡前应将组织芯片在室温中放置 60 分钟或 60℃恒温箱中烘烤 20 分钟。a 组织芯片置于二甲苯中浸泡 10 分钟,更换二甲苯后在浸泡 10 分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复:用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片:A 抗原热修复a 高压热修复 在沸水中加入 EDTA(ph8.0)或 0.01m 枸橼酸钠缓冲溶液( ph6.0).盖上不锈钢锅盖,但不能锁定。将玻片置于金属染色加上,缓慢加压,是玻片在缓冲液中浸泡五分钟,然后将盖子锁定,小阀门将会升起来。10 分钟后除去热源,置入凉水中,当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。b 沸热修复 电炉或水浴锅加热 0.01 枸橼酸钠缓冲液(ph6.0)至 95℃左右,放入组织芯片加热 10-15 分钟。c 微波炉加热 在微波炉里加热 0.01 枸橼酸钠缓冲液(ph6.0)至沸腾后将组织芯片放入,断电,间隔 5-10 分钟,反复 1-2 次。适用的抗原 Bcl-2. Bax. AR. PR. C-fos. x-jum. z-kit. c-myc. E-cadherin. ChromograninA. Cyclin. ER. Heatshock. Protein. HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等B 酶消化方法 常用 0.1%胰蛋白酶和 0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热 37℃,消化时间约为 5-30 分钟。适用于被固定遮蔽的抗原:包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等3、免疫组化染色 SP 法(1) 脱蜡、水化 (2)PBS 洗 2-3 次各 5 分钟 (3)3%H2O2(80%甲醇)滴加在 TMA 上,室温静置 10 分钟 (4)PBS 洗 2-3 次各 5 分钟 (5)抗原修复(6)PBS 洗 2-3 次各 5 分钟 (7)滴加正常山羊血清封闭液,室温 20 分钟,甩去多余液体(8)滴加 Ι 抗 50μl,室温静置 1 小时或 4℃过夜或 37℃1 小时(9)4℃过夜后需在 37℃复温 45 分钟(10)PBS 洗 3 次每次 2 分钟(11)滴加Ⅱ抗 45-50μl,室温静置或 37℃1 小时(12)Ⅱ抗中可加入 0.05%的 tween-20.(13)PBS 洗 3 次各 5 分钟(14)DAB 显色 5-10 分钟,在显微镜下掌握染色程度 (15)PBS 或自来水冲洗 10 分钟 (16)苏木精复染 2 分钟,盐酸酒精分化(17)自来水冲洗 10-15 分钟 (18)脱水、透明、封片、镜检。4、SABC 法(1) 脱蜡、水化 (2)PBS 洗 2 次各 5 分钟 (3)用蒸馏水或 PBS 配制新鲜的 3%H2O2,室温封闭 5-10 分钟,用蒸馏水洗 3 次(4)抗原修复(5) PBS 洗 5 分钟 (6)滴加正常山羊血清封闭液,室温 20 分钟,甩去多余液体(7)滴加 Ι 抗 50μl,室温静置 1 小时或 4℃过夜或 37℃1 小时(8)PBS 洗 3 次各 2 分钟(9)滴加生物素化Ⅱ抗,20℃-37℃ 20 分钟(10)PBS 洗 3 次
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