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免疫组化、HE染色步骤.doc

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免疫组化、HE染色步骤.doc
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骨组织石蜡切片制作步骤:1.固定:切取骨缺损出的骨组织,用 PBS 冲洗,放入 4%多聚甲醛缓冲液内固定 12—24h。2.脱钙:将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙 24h.3.脱水:将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗 3 次,再用 50%的酒精冲洗 2 次,常规脱水,70%酒精(60min) ,80%酒精(40min),95%酒精(30min),100%酒精 1(25min),100%酒精 II(25min) 。4.透明:二甲苯 I(35min),二甲苯 II(35min) 。5.包埋:将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡 I 1 小时,石蜡 II 1小时。6.切片:包埋后的组织块经修理后,用切片机切成 4um 的石蜡带,将组织石蜡块在 50℃温水中展片,然后用干净的载玻片捞片。7.烤片:将切好的组织片放入 63℃恒温箱中烤片 2 小时。免疫组化检测步骤:1.脱蜡:将组织切片放入 62℃恒温箱中烘烤 20min 二甲苯1(10min) 二甲苯 2(10min) 。2.水化:100%酒精 1(2min) 100%酒精(2min) 95%酒精(2min) 80%酒精(2min) 70%酒精(2min) 。3.PBS 冲洗 3 次,每次 5min.。4.抗原修复:将组织片置 0.01M 的柠檬酸缓冲液(PH6.0)中煮沸15min ,自然冷却至室温。5.PBS 冲洗 3 次,每次 5min。6.阻断:3%去离子水 37℃孵育 10min,以灭活内源性过氧化物酶活性。7.PBS 冲洗 3 次,每次 5min。8.滴加 1 抗(GFP 1:100 稀释, 4℃过夜)9.PBS 冲洗 3 次,每次 5min。10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂 1,37℃孵育,20min, PBS 冲洗 3 次,每次 5min。11. 滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂 2,37℃孵育,20min, PBS 冲洗 3 次,每次 5min。12.DAB 显色 5min。13.自来水冲洗 10min。14.苏木精复染 2min,盐酸酒精分化。15.自来水冲洗 10min。16.常规脱水,透明,封片,镜检。组织切片 HE 染色步骤1、将烘烤后的组织切片依次侵入二甲苯 1,二甲苯 II 进行脱蜡各10min。2、脱蜡后的组织切片依次浸入无水乙醇 I、无水乙醇 II、95%酒精、80%酒精、70%酒精中各 2 min,PBS 冲洗 2 次,每次 5min。3、苏木素染色 3 min, 自来水冲洗 3 min, 1 %盐酸酒精分色 2 s,自来水冲洗 2 min, 依次浸入 50 %、70 %、80 %的酒精中各 2 min,伊红浸泡 5 s,自来水冲洗 3min。4、 再将组织切片依次侵入 95 %酒精、无水乙醇 I、无水乙醇 II 中各 3min,最后再依次侵入二甲苯 I,二甲苯 II 各 5min。5.中性树胶封片,镜检。
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