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樟树籽蛋白质的提取与分析.ppt

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樟树籽蛋白质的提取与分析.ppt
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樟树籽蛋白质的提取与分析,08生物 林开鹏 指导老师:李卫林,目录,前言 材料与方法 结果与讨论 结论,前言,1 樟树籽简介 1)外形 樟树籽 ,又名樟梨、香樟大木姜子、樟子等。成熟的樟树籽呈扁球形 ,直径大约5~9mm ,每千粒重大约是 200 g,果皮肉质薄 ,能散发出芬芳的清香 2)药理作用樟树籽有驱风散寒、行气止痛之功效。癸酸(C10)已应用于医药行业合成鱼腥草素等消炎药 ,主要含有癸酸(C10)的樟树籽脂肪油已被试制成碳酸甘油脂 ,用于治疗脂肪代谢紊乱病症 ,并能降血脂及胆固醇。,材料与方法,材料樟树籽干燥 70摄氏度 24小时,备用 试剂石油醚(C.P.,沸程30~60℃),磷酸氢二钠(分析纯 AR),磷酸二氢钠(分析纯 AR), 氯化钠(分析纯 AR),95%乙醇(分析纯 AR),Tris (分析纯 AR),浓盐酸(分析纯 AR) ,SDS(分析纯 AR),甘油(分析纯 AR),溴酚蓝(分析纯 AR),-丙烯酰胺(分析纯 AR),巯基乙醇(分析纯 AR),甲醇(分析纯 AR),考马斯亮蓝R-250(分析纯 AR),冰醋酸(分析纯 AR) 器材FZ102型植物粉碎机,索氏提取器,离心机,紫外分光光度计,垂直电泳槽,电泳仪,微型凝胶电泳装置(厂家);水浴锅;Eppendorf管;微量注射器(50μl或100μl)。,实验,提取方法 1)称样 取10g样品装入滤纸斗中,把滤纸斗的开口处折起来封死;防止样品泄出滤纸斗。调整滤纸斗的高度,使其放在抽提管中时略低于虹吸管的上弯头处2)虹吸 向提取管中倒入石油醚,使其液面达到第一次液面的一半,冷凝管与自来水管相连轻轻打开自来水(冷凝用),将索氏提取仪整个装置放入恒温水浴锅中加热提取(水温80℃左右)提取时间2~2h,约虹吸10次以上 3)回收 取下平底烧瓶,将提取管的下端口插入回收瓶中,倾斜装置,提取管中的石油醚会虹吸而流入回收瓶中,达到回收的目的。再装上平底烧瓶,继续放入恒温水浴锅中加热直至冷凝管下端无石油醚滴下,表明平底烧瓶中的石油醚已经蒸干。注意:必须蒸干后才能放入干燥箱烘干,否则会引起火灾。取下平底烧瓶,回收提取管中的石油醚 4)称量粗脂质量将平底烧瓶放入120℃的电热鼓风干燥箱中烘15min,取出冷却后称重(须戴手套,以免烫伤)。再将平底烧瓶用洗涤剂洗净,于120℃的电热鼓风干燥箱中烘干(约15min),取出冷却后称重,两者的质量之差就是粗脂的质量。 5)蛋白质的溶解 将上述去脂烘干的样品置于烧杯中,加入ph为7.2的磷酸盐缓冲夜100ml浸提2h,蛋白质的分离方法,1 将浸提液均匀倒入两个离心管使两管质量相同,对称放入离心机中,调整离心机4000转 5分钟,将上清液倾入烧杯,加晶体NaCl少许(加速沉淀并使沉淀完全),待溶解后再加入95%的乙醇100ml混匀。观察有无沉淀析出2 将所得溶液离心,获得沉淀,用1% NaCl溶液溶解定容于250ml容量瓶中,备用。,蛋白质的定性,1茚三酮反应 取1支试管加入蛋白质溶液1毫升,再加0.5毫升0.1%茚三酮水溶液,混匀,在沸水浴中加热1—2分钟,观察颜色 在一小块滤纸上滴一滴0.5%的甘氨酸溶液,风干后,再在原处滴上一滴0.1%的茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干显色,观察 2 黄色反应 取一试管,置所提取的蛋白质溶液10滴及浓硝酸3~4滴,加热,冷却后再10%NaOH溶液5滴,观察颜色变化,,蛋白质的等电点,实验步骤:取同样规格的试营4支,向以上试管中各加 样品蛋白的醋酸钠溶液1毫升,加一管,摇句一管.此时1,2,3,4管的pH值依次为1,3,5,7观察其混浊度.静置10分钟后,再观察其混浊度.最混浊的一管的pH即为样品蛋白的等电点.,紫外光吸收法测定蛋白质浓度,在紫外分光光度计上,将未知的蛋白质溶液小心盛于石英比色皿中,以生理盐水为对照,测得280nm和260nm两种波长的吸光度(A280nm及A260nm)。 将A280nm及A260nm波长处测得的吸光度按下列公式计算蛋白质浓度。C = 1.45A280nm -0.74A260nm 式中C:蛋白质质量浓度(mg/ml); A280nm:蛋白质溶液在280nm处测得的吸光度; A260nm:蛋白质溶液在260nm处测得的吸光,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法—蛋白质的分子量测定,实验试剂配制 灌制分离胶 电泳 制备样品和上样 .灌制浓缩胶 考马斯亮蓝染色,结果与讨论,前处理粉碎后用烘箱对樟树籽进行干燥时,粉末热时湿度较大冷时结冻成固态,可以体现樟树籽中油脂含量较高,称量樟树籽10.002g索氏抽提得到蛋白和淀粉的混合物重7.623g,计算油脂的含量粗脂的含量(%)=2.377/10.002*100%=23.765%,,蛋白质的提取 乙醇沉淀蛋白法等 本实验采用了乙醇沉淀蛋
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