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第五章 酶分子的修饰.ppt

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第五章 酶分子修饰,定义:通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变,进而改变酶的某些功能和特性的技术。,,,酶分子,非必需基团,必需基团,活性中心 必需基团,活性中心外 必需基团,结合基团,催化基团,,非活性中心,,,活性中心,一、酶分子修饰的目的,(1) 提高酶活力:酶蛋白与大分子修饰剂交联后,修饰剂产生的空间障碍或静电斥力可能有效阻挡抑制剂对酶的进攻,同时“遮盖”保护了酶活性部位,使抑制剂和酶活性部位结合的难度增加。,(2)增强酶的稳定性:许多修饰剂分子存在多个活性反应基团,常常可以与酶形成多点交联,使酶分子的天然构象不容易伸展打开,同时减小酶分子内部基团的热振动,增强酶的热稳定性。,一、酶分子修饰的目的,(3) 降低或消除酶的抗原性:酶分子结构上有一些aa残基组成的抗原决定簇,进入机体后,就会诱发产生抗体,使酶失活,通过酶的修饰,有些组成抗原决定簇的基团与修饰剂形成了共价键,破坏酶分子上的抗原决定簇结构,使酶的抗原性降低甚至消失。,(4)探索酶的结构和功能的关系:通过酶分子修饰,研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响,探讨酶的结构和功能的关系。,二、选择酶分子修饰剂 特性:,(3) 被标记的残基在肽中稳定,容易通过降解分离出来并鉴定。,(4)反应程度能用简单的技术测定,(1)能选择性地与一个aa残基反应 。,(2)反应在保证酶蛋白不变性的条件下进行 。,修饰剂的要求:相对分子量较大;生物相容性和水溶性好;表面反应活性基团较多;修饰后酶活的半衰期较长;,三、选择反应条件,修饰反应总是尽可能在酶稳定的条件下进行,尽量少破坏酶活性功能的必需基团,反应的最终结果是要得到酶和修饰剂的高结合率及高酶活回收率。,pH是最重要的,增加pH 提高反应速率,,,,,降低pH 减小反应速率,反应活性高的修饰剂 pH在生理状态下,反应活性较低的修饰剂 需要较高的pH,酶的化学修饰,酶分子内部修饰,金属离子置换修饰,大分子结合修饰,酶蛋白侧链基团修饰,氨基酸置换修饰,肽链有限水解修饰,物理修饰,核酶的修饰,核苷酸链剪切修饰,核苷酸置换修饰,酶的化学修饰,酶分子内部修饰,金属离子置换修饰,大分子结合修饰,酶蛋白侧链基团修饰,氨基酸置换修饰,肽链有限水解修饰,物理修饰,核酶的修饰,核苷酸链剪切修饰,核苷酸置换修饰,第一节 金属离子置换修饰,一、定义:把酶分子中的金属离子换成另外一种金属离子,使酶的特性和功能发生改变的修饰方法。,用于修饰的金属离子,一般都是二价金属离子: 如Ca2+、Zn2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Co2+等,二、作用范围含有金属离子的酶金属酶特点:金属离子往往是酶活性中心的组成部分,对酶的活性起重要作用。 ( 1 )若除去酶活性中心的金属离子,酶会失活,重新加入原离子则酶复活。 ( 2 )加入不同的金属离子(即金属离子置换)则可使酶呈现不同特性。,三、金属离子置换修饰的过程,1、酶的分离纯化,2、除去原有的金属离子,3、加入置换离子,将欲进行修饰的酶经过分离纯化,除去杂质,获得一定纯度的酶液。,在纯化后的酶液中加入一定量的金属螯合剂,如EDTA等,使酶分子中的金属离子与EDTA形成螯合物,通过透析、超滤、分子筛层析等方法,将螯合物从酶液中除去,此时的酶液呈无活性状态。,加入一定量的另一种金属离子,酶蛋白与新加入的金属离子结合后,除去多余的置换离子。,三、金属离子置换修饰酶的作用,1、阐明金属离子对酶催化作用的影响:了解各种金属离子在酶催化过程中的作用,从而有利于阐明酶的催化作用机制。,2、提高酶活力:一般α—淀粉酶是杂离子型,即分子中大多数含有Ca2+,有些分子中则含有Zn2+、Mg2+或其他离子,如果将其他杂离子都换成Ca2+,则可以提高酶活力,并显著提高酶的稳定性。,三、金属离子置换修饰酶的作用,3、提高酶的稳定性,4、改变酶的动力学特性:Km、Vm、pH、温度等。,第二节 大分子结合修饰,一、定义:利用水溶性的大分子与酶蛋白的侧链基团共价结合,使酶分子的空间构象发生改变,从而改变酶的特性与功能的方法。,,目前应用最广泛的酶分子修饰方法,二. 修饰剂: 要求:具有较大的分子量、良好的生物相容性和水溶性。这样,经修饰的酶,其半衰期较长,活力回收较高。 聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐(dextran)、肝素(heparin)、蔗糖聚合物(Ficoll)等。,[ HO—CH2—CH2—O—CH2—CH2—OH ]n,(1)PEG分子量为1000一10000的修饰效果较好,用甲氧基PEG效果更好。,(2)溶解度高,溶于水,也溶于有机溶剂,没有抗原性,也没有毒性,生物相容性好。,聚乙二醇,三、修饰:修饰前活化,然后在一定条件下与酶分子共价结合。,1、修饰剂的活化 以PEG为例,PEG的羟基被活化,与酶的N端氨基结合(Lys残基的侧链氨基),(1)三氯均嗪法 PEG经三氯均嗪活化后,用石油醚抽提或减压蒸馏,制得活化PEG,后者与酶交联,制得修饰酶:,(2)琥珀酸酐法 常用二溴代琥珀酸酐在温和的碱性条件下将PEG活化,经减压浓缩制得活化PEG,活化PEG与酶分子上氨基发生交联反应,而得修饰酶:,(3) 重氮法 是将PEG末端羟基转化为重氮基团,再在弱碱性条件下与酶分子的酚基、咪唑基等反应,而生成修饰酶。 主要反应有以下三种。①对—硝基苄基氯活化法。,②N—羧甲氨基苯甲酐活化法,③4—氟—2—硝基重氮物活化法,2、修饰:活化后的大分子修饰剂与经分离纯化的酶液,以一定的比例混合,在一定的温度、pH值等条件下反应,使两者以共价键结合。 3、分离:通过凝胶层析等方法进行分离,将具有不同修饰度的酶分子分开,从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。,右旋糖苷————(高碘酸HIO4)活化右旋糖苷,四、大分子结合修饰的作用,1、提高酶活力: 一分子RNA酶 + 6.5分子右旋糖苷——酶活提高为原来的2.25倍。 一分子胰凝乳蛋白酶 + 11分子右旋糖苷——酶活提高原来的 5.1倍。 一分子胰蛋白酶 + 11分子右旋糖苷——酶活提高0.30倍,2、增强酶的稳定性,水溶性的大分子与酶分子共价结合进行酶分子修饰,可在酶分子外围形成保护层,起到保护酶的空间构象的作用,增加酶的稳定性。,水溶性大分子结合法修饰SOD可使其在体内的稳定性提高, 半衰期延长70—300倍如: 半衰期 相对稳定性 天然SOD 6 min 1右旋糖苷-SOD 7 h 70Ficoll(低分子量)-SOD 14 h 140 Ficoll(高分子量)-SOD 24 h 240聚乙二醇-SOD 35 h 350,3、改变酶的抗原性,通过大分子结合修饰,使酶分子的结构发生变化,降低或消除酶的抗原性,可以保持酶的催化功能。 如:精氨酸酶经PEG结合修饰后,其抗原性显著降低。色氨酸酶经PEG修饰后可完全消除其抗原性。L-天门冬酰胺酶经PEG结合修饰其抗原性完全消除。,a. 抗原:能引起体内产生抗体的物质b. 抗体:当外源蛋白非经口进入人或动物体内后,体内血清就可能出现与此外源蛋白特异结合的物质酶对人体是一种外源蛋白,当经注射进入人体后会成为抗原,刺激体内产生抗体。当这种酶再次进入体内,抗体就会与作为抗原的酶特异结合,而使酶失去催化能力。,抗体与抗原间特异结合是由于它们之间特定分子结构引起的。用酶分子修饰法使酶的结构产生改变,抗体、抗原就不再特异结合,可能降低或消除其抗原性。 利用水溶性大分子对酶进行修饰可降低或消除酶的抗原性。,第三节 酶蛋白侧链基团修饰,一、定义:采用一定方法使酶分子的侧链基团发生改变,从而改变酶分子的特性和功能。,侧链基团:组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有:氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基、吲哚基。,,侧链基团修饰剂:采用的各种小分子化合物。20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰,它们一般具有亲核性。,根据氨基酸侧链R基的极性,20种氨基酸可分成4类:,1.带正电荷的极性R基氨基酸(共3种): 赖氨酸(Lysine,Lys,K), 精氨酸(Arginine,Arg,R), 组氨酸(Histidine,His,H),2.带负电荷的极性R基氨基酸(共2种): 天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D), 谷氨酸(Glutamic acid,Glu,E),3.无电荷的极性R基氨基酸(共7种): 丝氨酸(Serine,Ser,S), 苏氨酸(Threonine,Thr,T), 酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y), 半胱氨酸(Cysteine,Cys,C), 天冬酰胺(Asparagine,Asn,N), 甘氨酸(Glycine,Gly,G), 谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q),4. 非极性R基氨基酸(共8种):丙氨酸(Alanine,Ala,A),亮氨酸(Leucine,Leu, L),缬氨酸(Valine,Val,V)), 异亮氨酸(Isoleucine,Ile,I),苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F),色氨酸(Tryptophan,Trp,W),甲硫氨酸(Methionine,Met,M),脯氨酸(Proline,Pro,P),这些基团可以组成各种副键,对酶的空间结构的形成和稳定起着重要作用。如果这些基团发生改变,就会引起副键的改变,使空间结构发生改变,从而引起酶的特性和功能的改变。,酶分子的侧链基团修饰,可以研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响.并可以用于研究酶的活性中心的必需基团。如果某一基团修饰后不引起酶活力的显著变化,则可以认为这个基团属于非必需基团;如果某一基团修饰后引起酶活力的显著变化,则可以认为这个基团可能是酶催化的必需基团。,,,一、氨基修饰,来源:Lys, Arg, His, Gln 修饰反应:酰基化与烷基化 修饰剂:三硝基苯磺酸(TNBS)、丹磺酰氯(DNS)、 2,4-二硝基氟苯(DNFB)、碘乙酸、碘乙酰胺、 2,4,6-三硝基苯磺酸、亚硝酸等,①乙酸酐修饰,② 2,4,6—三硝基苯磺酸修饰,③2,4—二硝基氟苯修饰(Sanger反应),④氨基的烷基化。这类试剂包括卤代乙酸、芳香卤和芳香磺酸等。,⑤丹磺酰氯(DNS)修饰。,⑥苯异硫氰酸酯(PITC)修饰(即Edman反应),二、羧基的化学修饰 修饰羧基的反应专一性较差。 常用水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸。可定量测定酶分子中羧基的数目。+  水溶性碳化二亚胺,三、巯基的化学修饰来源:Cys修饰反应:烷基化修饰剂:碘乙酸(IAA) 碘乙酰胺(IAM) E-SH + R-X - E-SR +HX N-乙基马来酰亚胺(NEM)(常用的专一修饰巯基试剂) E-SH + ,,四、咪唑基的化学修饰来源:His修饰反应:酰基化与烷基化酰基化修饰剂:常用焦碳酸二乙酯(diethyl paracarbonate)+  + C2H5OH +CO2 烷基化修饰剂:碘乙酸,+ ICH2COOH  + HI,五、吲哚基的化学修饰来源:Trp修饰反应:氧化反应修饰剂: N-溴代琥珀酰亚胺,各种氨基酸侧链的修饰剂,但解释修饰效果须十分小心,因为: ①任何一种修饰剂不是绝对专一的。 ②有些修饰剂引起蛋白质构象变化——失活, 不一定是活性中心基团被共价修饰。 ③不同部分的相同基团,修饰效果不同,分子内部的必需基团,不易被修饰。,六、交联修饰用双功能基团试剂(如戊二醛),与酶分子内不同肽链部分共价交联,使酶分子空间构象更加稳定。,戊二醛有两个醛基,均可与酶或蛋白质的游离氨基反应,使酶蛋白交联。,第四节 氨基酸置换修饰,一、定义:将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸,引起酶蛋白空间构象的改变,从而改变酶的某些特性和功能的方法。,aa是酶的化学结构和空间结构的基础。,二、aa置换修饰酶的作用,2、增强酶的稳定性,1、提高酶活力,3、使酶的专一性发生改变:,酪氨酰-tRNA合成酶:催化Tyr和所对应的tRNA合成酪氨酰-tRNA。该酶的Thr51若被pro置换,酶对ATP的亲和性提高近100倍,酶活力提高25倍。,T4-溶菌酶:Ile3被Cys置换后,Cys-3可与Cys-97形成二硫键,置换后的T4-溶菌酶,其活力保持不变,但该酶的稳定性却大大提高。,枯草杆菌蛋白酶:活性中心上的Ser置换成Ile后,酶对蛋白质和多肽的水解活性消失,而出现催化硝基苯酯进行水解反应的活性。,,三、氨基酸置换修饰的方法通过两个途径实现:,化学修饰法:由于可用试剂的限制,获得的种类少。 定点突变技术:利用基因操纵技术。,定点突变技术应用于酶分子修饰的主要过程:,(1)新酶分子结构的设计,(2)突变基因碱基序列的确定,(3)突变基因的获得,(4)新酶的获得,(1)新酶分子结构的设计,设计出欲获得的新酶RNA的核苷酸序列或aa序列,确定欲置换的核苷酸或aa及其位置。,(2)突变基因碱基序列的确定:核酸类酶,根据欲获得的酶RNA的核苷酸排列次序。蛋白类酶,根据欲获得的酶蛋白的aa排列次序。 同义密码子,(3)突变基因的获得:通过PCR技术。 用DNA合成仪合成1~2个碱基被置换了的寡核苷酸,以寡核苷酸为引物通过聚合酶链反应(PCR)或M13质粒等定位突变技术获得所需要的大量突变基因(寡核苷酸诱导的定位突变),(4)新酶的获得:将PCR获得的大量突变基因进行体外重组,插入到适宜的基因载体中,然后通过转化、转导、基因枪、显微注射等技术,转入适宜的寄主细胞中,在适宜的条件下进行表达,就可获得经过修饰的酶。,例一:酪氨酰-tRNA合成酶催化Tyr和所对应的tRNA合成酪氨酰-tRNA。该酶的Thr51若被pro置换, 苏氨酸密码子(ACU,ACC,ACA,ACG), 脯氨酸密码子(CCU,CCC,CCA,CCG), mRNA上只需将密码子上的第一个碱基A换成C,对应的基因只需将T换成G。,第五节 肽链有限水解修饰,在肽链的限定位点进行水解,使酶的空间结构发生某些精细的改变,从而改变酶的催化特性的方法。,酶蛋白的肽链被水解后,可能出现以下三种情况中的一种: 1 引起酶活性中心的破坏,酶失去催化功能。 2 仍维持活性中心的完整构象,保持酶活力。 3 有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位,酶活力提高。后两种情况,肽链的水解在限定的肽键上进行,称肽链有限水解。,对酶进行肽链有限水解,通常使用专一性较强的蛋白酶或肽酶为修饰剂。,(蛋白酶修饰,切去六肽) 胰蛋白酶原————— 有活力的胰蛋白酶 (修饰)天冬氨酸酶 ———— 使酶活提高4-5倍。(羧基端水解10肽),,,除了用专一性的蛋白酶或肽酶外(修饰剂),也可采用其他方法使肽链部分水解,进行修饰。(EDTA处理) 如:枯草杆菌中性蛋白酶 在纯水或稀盐缓冲液透析 酶部分水解成小肽段 仍有蛋白酶活性,不产生抗原性。,,,,,应用:,1)提高酶活力:,2)消除抗原性:,第六节 核苷酸链剪切修饰,核酸类酶 在核苷酸链的限定位点进行剪切,使酶的结构发生改变,从而改变酶的特性和功能的方法。 如四膜虫26S rRNA前体经过自我剪接作用形成成熟的26S rRNA,最后得到一个5´ 端失去19个核苷酸残基的多功能核酸类酶L-19IVS,第七节 核苷酸置换修饰,核酸类酶 将酶分子上核苷酸链上的某一个核苷酸置换成另一个核苷酸,从而改变酶的催化特征的修饰方法称为核苷酸置换修饰。 方法:定位突变技术,第六节 物理修饰,一、定义:通过各种物理方法使酶分子的空间构象发生某些改变,从而改变酶的某些特性和功能。,,高温、高压、高盐、低温、真空、失重、极端pH、有毒环境等极端条件下。,物理修饰的特点:不改变酶的组分和基团,酶分子中的共价键不发生改变,只是在物理方法的作用下,副键发生某些变化和重排。 如:用高压方法处理纤维素酶以后,该酶的最适温度有所降低;在室温下,高压修饰酶比天然酶的活力提高了。,变性剂改变空间构象在某些变性剂的作用下,先使酶原有空间构象破坏,然后在不同的条件下,使酶分子重新构建新的构象。 如:先用盐酸胍等变性剂使胰蛋白酶的原有构象破坏,通过透析除去变性剂后,在不同温度下,使酶重新折叠形成新的构象。 不同温度下重新构建构象的胰蛋白酶的稳定性不同。50 ℃条件下重新构建的新构象与20℃重建构象的酶的稳定性提高5倍。,
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