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第五章 酶分子的修饰.ppt

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第五章 酶分子修饰,定义:通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变,进而改变酶的某些功能和特性的技术。,,,酶分子,非必需基团,必需基团,活性中心 必需基团,活性中心外 必需基团,结合基团,催化基团,,非活性中心,,,活性中心,一、酶分子修饰的目的,(1) 提高酶活力:酶蛋白与大分子修饰剂交联后,修饰剂产生的空间障碍或静电斥力可能有效阻挡抑制剂对酶的进攻,同时“遮盖”保护了酶活性部位,使抑制剂和酶活性部位结合的难度增加。,(2)增强酶的稳定性:许多修饰剂分子存在多个活性反应基团,常常可以与酶形成多点交联,使酶分子的天然构象不容易伸展打开,同时减小酶分子内部基团的热振动,增强酶的热稳定性。,一、酶分子修饰的目的,(3) 降低或消除酶的抗原性:酶分子结构上有一些aa残基组成的抗原决定簇,进入机体后,就会诱发产生抗体,使酶失活,通过酶的修饰,有些组成抗原决定簇的基团与修饰剂形成了共价键,破坏酶分子上的抗原决定簇结构,使酶的抗原性降低甚至消失。,(4)探索酶的结构和功能的关系:通过酶分子修饰,研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响,探讨酶的结构和功能的关系。,二、选择酶分子修饰剂 特性:,(3) 被标记的残基在肽中稳定,容易通过降解分离出来并鉴定。,(4)反应程度能用简单的技术测定,(1)能选择性地与一个aa残基反应 。,(2)反应在保证酶蛋白不变性的条件下进行 。,修饰剂的要求:相对分子量较大;生物相容性和水溶性好;表面反应活性基团较多;修饰后酶活的半衰期较长;,三、选择反应条件,修饰反应总是尽可能在酶稳定的条件下进行,尽量少破坏酶活性功能的必需基团,反应的最终结果是要得到酶和修饰剂的高结合率及高酶活回收率。,pH是最重要的,增加pH 提高反应速率,,,,,降低pH 减小反应速率,反应活性高的修饰剂 pH在生理状态下,反应活性较低的修饰剂 需要较高的pH,酶的化学修饰,酶分子内部修饰,金属离子置换修饰,大分子结合修饰,酶蛋白侧链基团修饰,氨基酸置换修饰,肽链有限水解修饰,物理修饰,核酶的修饰,核苷酸链剪切修饰,核苷酸置换修饰,酶的化学修饰,酶分子内部修饰,金属离子置换修饰,大分子结合修饰,酶蛋白侧链基团修饰,氨基酸置换修饰,肽链有限水解修饰,物理修饰,核酶的修饰,核苷酸链剪切修饰,核苷酸置换修饰,第一节 金属离子置换修饰,一、定义:把酶分子中的金属离子换成另外一种金属离子,使酶的特性和功能发生改变的修饰方法。,用于修饰的金属离子,一般都是二价金属离子: 如Ca2+、Zn2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Co2+等,二、作用范围含有金属离子的酶金属酶特点:金属离子往往是酶活性中心的组成部分,对酶的活性起重要作用。 ( 1 )若除去酶活性中心的金属离子,酶会失活,重新加入原离子则酶复活。 ( 2 )加入不同的金属离子(即金属离子置换)则可使酶呈现不同特性。,三、金属离子置换修饰的过程,1、酶的分离纯化,2、除去原有的金属离子,3、加入置换离子,将欲进行修饰的酶经过分离纯化,除去杂质,获得一定纯度的酶液。,在纯化后的酶液中加入一定量的金属螯合剂,如EDTA等,使酶分子中的金属离子与EDTA形成螯合物,通过透析、超滤、分子筛层析等方法,将螯合物从酶液中除去,此时的酶液呈无活性状态。,加入一定量的另一种金属离子,酶蛋白与新加入的金属离子结合后,除去多余的置换离子。,三、金属离子置换修饰酶的作用,1、阐明金属离子对酶催化作用的影响:了解各种金属离子在酶催化过程中的作用,从而有利于阐明酶的催化作用机制。,2、提高酶活力:一般α—淀粉酶是杂离子型,即分子中大多数含有Ca2+,有些分子中则含有Zn2+、Mg2+或其他离子,如果将其他杂离子都换成Ca2+,则可以提高酶活力,并显著提高酶的稳定性。,三、金属离子置换修饰酶的作用,3、提高酶的稳定性,4、改变酶的动力学特性:Km、Vm、pH、温度等。,第二节 大分子结合修饰,一、定义:利用水溶性的大分子与酶蛋白的侧链基团共价结合,使酶分子的空间构象发生改变,从而改变酶的特性与功能的方法。,,目前应用最广泛的酶分子修饰方法,二. 修饰剂: 要求:具有较大的分子量、良好的生物相容性和水溶性。这样,经修饰的酶,其半衰期较长,活力回收较高。 聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐(dextran)、肝素(heparin)、蔗糖聚合物(Ficoll)等。,[ HO—CH2—CH2—O—CH2—CH2—OH ]n,(1)PEG分子量为1000一10000的修饰效果较好,用甲氧基PEG效果更好。,(2)溶解度高,溶于水,也溶于有机溶剂,没有抗原性,也没有毒性,生物相容性好。,聚乙二醇,三、修饰:修饰前活化,然后在一定条件下与酶分子共价结合。,1
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