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第五讲__酶的分子修饰.ppt

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第五讲 酶分子修饰,讲课:阳 飞 系部:生化系,作业,第五讲 酶分子修饰,教学目标: 了解有关酶分子修饰的重要应用以及酶分子的物理修饰作用 理解蛋白酶化学修饰的方法和意义 掌握酶分子化学修饰的形式、目的、原理与特点 教学重点:酶分子化学修饰的方法和意义、酶分子化学修饰的形式 教学难点:化学修饰的原理与特点,第五讲 酶分子修饰,5.1、酶分子修饰的定义及其意义5.2、酶分子修饰方法5.3、酶修饰后的性质变化 5.4、酶的分子定向进化,分析酶在工业生产中应用受到极大限制的原因?,热稳定性差 活力低 耐受pH范围窄 分子量过大 成本高 来源有限 有异体反应,?,酶的应用受到了很大限制促使科研工作者必须不断地开展新的研究,用化学或分子生物学方法对酶分子进行改造,以满足各种反应条件对酶的需求,克服天然酶的缺陷。随着各个学科及相关技术的发展,特别对酶结构与功能的深入了解、基因工程及固定化技术的普及,酶的分子改造工程进入实用阶段。 总体来说酶的分子工程分两部分: ★分子生物学水平:即用基因工程方法对DNA进行分子改造,以获得化学结构更合理的酶蛋白; ★对天然酶分子进行改造:包括酶一级结构中氨基酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等。,5.1、酶分子修饰的定义及其意义,1、定义:通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变,从而改变酶的某些特性和功能的技术过程。,即在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团(物质),特别是具有生物相容性的物质,进行共价连接,从而改变酶的结构和性质。,讨论:自然界中存在酶分子改造修饰吗?,酶原激活可逆共价调节,?,胃蛋白酶原、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原,磷酸化酶a与磷酸化酶b互变,2、酶分子修饰的意义,增强酶的稳定性(stability) 提高酶的活力(activity) 降低或消除酶的抗原性(immunological property) 研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象(structure)的影响,3、酶分子修饰的基本要求和条件,(1)对酶性质的了解: ①酶的稳定性:热稳定性、酸碱稳定性、抑制剂等 ②酶活性中心的状况:活性中心基团、辅因子以及分子大小、性状、亚基数 (2)对修饰剂的要求: ①良好的生物相容性和水溶性 ②修饰剂的相对分子质量(较大)、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性 ③修饰剂上反应基团的数目及位置 ④修饰剂上反应基团的活化方法与条件 (3)对酶反应条件的选择: ①反应体系中酶与修饰剂的分子比例 ②反应体系中的溶剂性质、盐浓度和pH条件 ③反应温度及时间,5.2、酶分子的修饰方法,物理修饰: 不改变酶的组成单位及其基团的修饰,即酶分子中的共价键不发生改变,只是在物理因素(高温、高压、高盐、极端pH值)作用下,副键发生某些变化和重排。 化学修饰: ★广义:指凡涉及共价部分或部分共价键的形成或破坏的转变。 ★狭义:指在较温和的条件下以可控的方式使一种蛋白质与某些化学试剂起特异反应,从而引起单个氨基酸残基或其功能基团发生共价的化学变化。,一、影响酶分子化学修饰的主要因素,1、酶蛋白功能基团的反应性 蛋白质功能基团所处的环境会强烈地影响它的物理和化学性质 蛋白质分子的表面特点也影响化学试剂的接近因此,有必要考察局部衡区对功能基和修饰剂的影响。由于功能基的反应性是通过它的亲核性来测量的,应当强调pKa和影响pKa的因素。 2、修饰剂的反应性,1、影响酶蛋白功能基团的反应性因素,①微区的极性 ②基团间的氢键 ③静电效应 ④位阻效应 ⑤其它,电荷转移、共价键形成、金属螯合、旋转自由度,①微区的极性,微区的极性是决定基团解离状态的关键因素之一。极性对整个反应速度影响与反应的类型有密切关系。 从整体看来,局部极性的改变对色氨酸、甲硫氨酸和胱氨酸反应性的影响较小 对氨基和组氨酸反应性的影响较大 对酪氨酸、半胱氨酸和羧基的反应性影响最大,②基团间的氢键作用,在蛋白质的酚基-羧基相互作用中,羧基的pKa应比正常值低,而酚基的pKa高于正常值。,+H+,③静电效应,用高分辨率的核磁共振组氨酸残基的电离行为进行研究表明,不同蛋白质中的组氨酸残基的pKa是不同的;原因可能在于带电基团相互静电作用的影响。,④位阻效应,烷基在空间上紧靠功能基,会使修饰剂不能与功能基接触,出现位阻效应。 对枯草杆菌蛋白酶BPN的X射线衍射研究指出:10个酪氨酸残基均在蛋白质分子表面,而且苯酚的羟基几乎在所有情况下都没有形成氢键。对它进行彻底硝化和碘化后,10个酪氨酸中只有8个被修饰。若没有X射线衍射研究结果,很可能解释为至少有2个酪氨酸残基被包埋在分子内部,但实际情况并不是这样的,这种情况很可能是空间障碍引起的。,★旋转自由度,加快修饰反应速度的一个重要原因是限制了构象的总数(即限制了旋转自由度),这种
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