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第六章 酶分子修饰.ppt

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Chapter 6 Modification of Enzyme Molecule,第五章 酶的分子修饰,6.1 什么是酶分子修饰?,通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变,从而改变酶的催化特性的技术过程称为酶分子修饰。 即:在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团(物质),特别是具有生物相容性的物质,进行共价连接,从而改变酶的结构和性质。,酶分子修饰的意义,提高酶的活力 activity 增强酶的稳定性 stability 降低或消除酶的抗原性 immunological property 改变底物的专一性substrate specificity 研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响 structure,6.2 酶分子修饰的基本要求和条件,对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。(1)酶的稳定性 热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。 (2)酶活性中心的状况 活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。,酶分子修饰的条件,修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行,并尽量不破坏酶活性功能的必需基团,使修饰率高,同时酶的活力回收高。 (1)pH与离子强度 pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同,反应性能也不同。 (2)修饰反应的温度与时间 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。 (3)反应体系中酶与修饰剂的比例,6.3 酶分子的修饰方法,金属离子置换修饰, 大分子结合修饰(共价/非共价) 侧链基团修饰 肽链有限水解修饰 氨基酸置换修饰 酶分子的物理修饰,(1) 酶的金属离子置换修饰,把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子,使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰,置换修饰的目的: 阐明金属离子对酶催化作用的影响 提高酶的催化效率 增强酶的稳定性 改变酶的动力学特征,金属离子置换修饰的过程,a. 酶的分离纯化b. 除去原有的金属离子c. 加入置换离子金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。用于金属离子置换修饰的金属离子,一般都是二价金属离子。,(2) 酶的大分子修饰,采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合,使酶分子的空间构象发生改变,从而改变酶的催化特性的方法。目的: 提高酶催化效率 增强稳定性 降低或消除酶蛋白的抗原性,大分子修饰(共价)的过程,修饰剂的选择,修饰剂的活化,修饰,分离,,,,聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性,在体内无毒性、无残留、无免疫原性,并可消除酶的抗原性,使其末端活化后可以与酶产生交联,因而,它被广泛用于酶的修饰。,(3) 酶分子的侧链基团修饰,采用一定的方法(一般为化学法)使酶蛋白的侧链基团发生改变,从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法,称为侧链基团修饰。 作用: 研究酶的分子结构与功能 测定某一种基团的数量 优化酶的特性 获得自然界不存在的新酶种,催化活性/非催化活性基团的修饰,对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质,改变酶对特殊底物的束缚能力。 经常被修饰的残基是: 亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His 亲电的Tyr、Trp对催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分来实现氨基酸的取代。,Ⅰ、氨基修饰,脱氨基作用:,共价结合:,,凡能使侧链氨基发生改变的化合物称为氨基修饰剂,作用于侧链的氨基发生脱氨基作用或与氨基共价结合将其屏蔽。,Ⅱ、羧基修饰,修饰剂与酶蛋白侧链的羧基进行酯化、酰基化等反应,使构象特性发生变化。,例:,Ⅲ、巯基修饰,半胱氨酸残基的侧链含有巯基,多为活性中心,还可形成二硫键,有重要作用。,烷基化试剂修饰:,Ⅳ、基它修饰,胍基修饰:精氨酸侧链,二羰基化合物与之生成稳定杂环咪唑基修饰:组氨酸侧锭,酶活性中心的必需基团。,酚基修饰:酪氨酸残基吲哚基修饰:色氨酸修饰,疏水性强,位于分子内部,难修饰。,Ⅴ、分子内交联修饰,含双功能基团的化合物(双功能试剂)与酶蛋白分子中相距较近的两个侧链基团之间形成共价交联,从而提高酶的稳定性的修饰方法。 如:戊二醛、已二胺、葡聚糖二乙醛戊二醛两端都含有醛基,可以与酶分子中的氨基反应形成酰胺键或者与羟基反应形成酯键。己二胺两端都含有氨基,可以与酶分子中的羧基反应形成酰胺键。,酶蛋白的肽链被水解后,可能出现以下3种情况: (1)若肽链水解后引起酶活性中心的破坏,则酶将失去其催化功能。 (2)若将肽链的一部分水解后,仍可维持其活性中心的完整构象,则酶的活力仍可保持或损失不多;但是其抗原性等特性将发生改变。 (3)肽链部分水解后,有利于活性中心与底物的结合并且形成准确的催化部位的话,则酶可显示出其催化功能或使酶活力提高。,(4) 酶蛋白主链修饰(肽
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