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烟草瞬时转化.doc

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本氏烟草(N. benthamian)瞬时表达及相关实验方法:一、 农杆菌介导的烟草瞬时转化:A、 实验步骤:1、 根据实验需要,将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中,并转化农杆菌。2、 将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的 YEP 中,28℃,200rpm 过夜。*估算时间,防止农杆菌液浓度超过 1OD,否则会影响转化效率。3、当菌液 OD 值介于 0.6~1.0 之间时,1000g,5min 离心收集农杆菌。4、用 2ml Induction medium(without AS) 轻柔重悬农杆菌,然后再次离心收集菌液。5、重复步骤 4。6、所得沉淀用 1ml Induction medium 重悬。7、室温放置 1~4 小时8、测 OD 值,根据实验需要,配置侵染液(组合详见下文) 。9、 用不加针头的注射器将侵染液注射进 6~8 周大的本氏烟草叶片中。*使用注射器时注意安全,防止针头扎到手,使用完的注射器要把针头套套上再扔,或者将针头放到注射器里面,避免伤害他人;注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套,防止交叉污染。B、试剂:Induction medium:MES-KOH PH 5.7 10nMMgCl2 10mM AS 200uM推荐提前配制母液1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌,4℃保存,用时稀释 100 倍。1M MgCl2 过滤灭菌,4℃保存,用时稀释 100 倍。0.2M AS 溶于 DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌,分装(避免反复冻融) ,-20℃。用高压灭菌的超纯水稀释。C、关于表达时间:烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间,一般注射 24 小时之后到一周之内都会有表达。严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段,但一般注射后 48 小时至 72 小时不同蛋白表达量都比较可观,不要错过。D、关于侵染液浓度:推荐每个菌株的浓度在 0.1~0.2 之间。过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。
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