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类型医学真菌实验室常规检查方法.pdf

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    1、医学真菌实验室常规检查方法余进李若瑜真菌感染的日益增多已成为广大临床医师的共识,这一现状对微生物实验室真菌检查技术也提出了更高的要求。规范的标本取材、保存、处理以及正确的真菌镜检和培养方式可以提高阳性率检出,对临床诊断和治疗提供有价值的帮助。笔者就标本取材、真菌镜检和真菌培养的操作规范以及致病真菌鉴定原则进行简要的介绍。一、各种标本的取材要求标本的种类和质量是决定分离和鉴定病原真菌成败的最基本因素。规范的采集方法是开展各项实验室检查的基础。检验医师应正确掌握各种标本的采集、处理方法,得到高质量的临床标本。用于真菌学检查的标本采集大部分与细菌学检杳取材要求一致,如血液、尿液、痰液、支气管肺泡灌洗

    2、液、胸腔积液、腹腔积液、脑脊髓液、关节腔积液和组织等。特殊部位,如甲、皮肤、毛发、角膜、黏膜等取材时有特殊要求。甲标本采集前用70酒精彻底清洁病甲,钝刀用火焰灭菌,冷却后从甲变色、萎缩或变脆的部位、健甲与病甲的交界处取材,保证一定深度,最好能达到甲板腹侧,标本量应足够大,可以在平皿中接种810个部位。对于伴有甲沟炎患者的取材,应采用棉拭子,70酒精清洁局部后沾取损害分泌物。皮屑标本采集前用70酒精清洁取材区域,钝刀火焰灭菌,冷却后从损害的边缘向外刮取或用剪刀剪去疱顶。如果鳞屑量较少,可采用透明胶带法取材旧J,将透明胶带黏着面紧压于损害之上,然后剥下,将黏着面向下贴在透明载玻片上送检。毛发采集时

    3、选择无光泽毛发或者在毛囊口折断的毛发。先将镊子用火焰灭菌,然后用镊子将毛发从头皮拔除,尽量保留毛根部。口腔黏膜可用钝刀刮片或拭子取材,阴道黏膜可用拭子取材,一般不用浸湿。对疑诊真菌性角膜溃疡的取材应用灭菌小匙或钝刀刮取溃疡部位,应自溃疡的基底和其边缘取材。由于标本量往往有限,最好在取材同时进行平皿培养和涂片镜检。对于引流脓肿或溃疡脓液,用钝刀尽可能从损害的深部取材,非引流的皮下脓肿或窦道中的脓液要用无菌注射器从脓疡中抽吸,并将抽吸物装入无菌容器中。如脓液中有颗粒(见于足菌肿)应注意收集。如果窦道开口部位有翘起的痂屑,通常在其下方的脓液中可发现颗粒。标本在采集后应该尽快送检,在无菌、防渗漏的容器

    4、中运输,最好在1-2 h内进行真菌镜检并转种在初级分离培养基上。甲屑和毛发可以在干燥的环境中保存数El。DOI:IO3760enm jisan1009-9158200901034作者单位:100034北京大学第一医院北京大学真菌和真菌病研究中心继续教育二、真菌镜检对临床标本的直接显微镜检查是最简单也是很有价值的实验室诊断方法。其优点在于简便、快速,无菌部位的阳性结果可直接确定真菌感染。但是由于阳性率较低,阴性结果亦不能排除诊断。直接镜检对于浅表和皮下真菌感染最有帮助。在皮肤刮屑、毛发或甲标本中发现皮肤癣菌、念珠菌和马拉色菌的成分可提供对相应真菌病的可靠诊断。如在无菌体液的直接镜检中发现真菌成分

    5、常可确立深部真菌病的诊断,例如在脑脊髓液中检测到带荚膜的新生隐球菌酵母细胞,或外周血涂片中检测到荚膜组织胞浆菌细胞。但一般在有菌部位只有发现大量真菌菌丝方才有意义,通过直接镜检一般可以区分念珠菌、隐球菌、暗色真菌、毛霉(接合菌)等菌的感染,进一步明确鉴定菌种需要通过培养鉴定来完成。直接镜检一般方法1是将标本置于载玻片上,加一滴浮载液,盖上盖玻片,放置片刻或微加热,即在火焰上快速通过23次,不应使之沸腾,以免结晶。然后轻压盖玻片,驱逐气泡并将标本压薄,用吸纸吸去周围溢液,置显微镜下检查。检查时应遮去强光,先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子,然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列等。

    6、采集的标本也可涂在载玻片上,空气干燥后,经革兰染色、银染等方法染色后观察。真菌镜检常用浮载液有氢氧化钾溶液、生理盐水(或水)、墨汁、乳酸酚苯胺蓝(棉蓝)染液和Park墨水等。氢氧化钾溶液在浅部真菌感染的直接镜检中最为常用。一般使用溶液浓度为1020。氢氧化钾可消化蛋白质并使角化组织透明,因而可以更清楚地观察到标本中的真菌。真菌胞壁的几丁质对检测浓度的氢氧化钾有一定的抵抗作用,但一定时间之后真菌也会溶解。因此,氢氧化钾可用于各种临床标本的检查。生理盐水(或水)可直接观察黏膜或组织碎块,缺点是易于干燥,只适于短时间检查。墨汁涂片用于检测脑脊髓液中新生隐球菌(图1),墨汁不能使隐球菌荚膜多糖着色,但

    7、可提供黑色背景而使荚膜更亮而易于观察p J。乳酸酚棉蓝染液是真菌镜检的标准浮载剂。棉蓝系酸性染料,能使真菌着色呈蓝色;乳酸对真菌有杀灭作用,含有甘油,能使涂片保存相当的时间,也是常用的封固保存液。Park墨水染色法H1由20氢氧化钾溶液和派克墨水各半混合而成,为马拉色菌的常用染色方法(图2)。氢氧化钾用于溶解鳞屑角质,如果染纯培养的菌则可用蒸馏水代替氢氧化钾。国产的蓝黑墨水也可以试用。染色时间至少要10 min,若能过夜,次日染色效果更好。镜下观察时将光线调至最亮,菌体染为深蓝色。万方数据田1显微镜下隐球菌墨汁染色图圈2显微镜下马拉色菌Park墨水染色图染色检查是组织病理学应用的检测方法,在真

    8、菌感染的某些涂片检查中也可应用。革兰染色中真菌为阳性,被染成蓝黑色,此方法适用于酵母菌、孢子丝菌、组织胞浆菌检测。银染色可使真菌壁着黑色,与周围组织反差大,是真菌感染很好的筛选方法。肺孢子菌感染的痰或支气管肺泡灌洗液涂片检查可用此染色方法,可以见到染成黑色的包囊体或滋养体。吉姆萨染色可用于骨髓涂片和其他标本中荚膜组织胞浆菌和马尔尼菲青霉的检测。过碘酸-雪夫染色(PAS)是组织病理学技术中最常用的真菌特殊染色法。以亮绿或苏木素复染,真菌着红色,组织中细胞核着绿色或蓝色。钙荧光白染色(ealcofluor white stain)是近年来临床常用的真菌检测方法。该染料是一种非特异的染料,可结合真菌

    9、胞壁的多糖和某些原核生物。在紫外光下真菌可染成浅蓝或绿色,有研究显示其敏感性优于氢氧化钾涂片1。该方法的缺点是荧光背景易造成判读错误。荧光抗体染色可直接有效地从组织或体液中检出真菌,敏感性更高,还具有种属特异性,已用于检测荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、新生隐球菌、曲霉、念珠菌、巴西副球孢子菌和肺孢子菌等引。三、真菌培养真菌培养是实验室检查中的重要环节,培养出致病真菌是进一步鉴定菌种的前提条件。真菌培养第一步是从临床标本中培养真菌的初代培养,初代培养后进一步进行分离纯化培养和鉴定培养。不同致病真菌每一步所采用的培养基,培养时间和培养温度存在一定的差异。大多数标本都可以在培养基上直接接种。当液体标本

    10、(无菌体液、尿液)量大时,在转接前应该采取离心浓缩的方法,取沉淀进行培养,以增强真菌的检出率。活检组织应该尽量增大标本在培养基上的暴露面积。组织标本应剪碎后接种,如果有条件应该用组织研磨器匀浆化标本。在磨碎时应当轻柔,过度用力可能会损伤菌丝。如果怀疑接合菌感染,组织不应进行研磨和匀浆,而应剪成较大组织块直接接种。甲标本应尽量剪碎后接种。常规的真菌培养需要在2830下进行。对于可疑深部感染的真菌,一般培养37 d,对于导致皮肤皮下组织感染的真菌,培养时间应为34周。一般初代培养选用沙氏培养基(SDA)或者马铃薯琼脂培养基(PDA),采用试管培养,一般同时培养2管,其中一管可添加抗生素(氯霉素或硫

    11、酸庆大霉素均可)。放线菌酮对部分霉菌及酵母菌的生长有抑制作用,对皮肤癣菌无明显生长抑制,若仅希望培养出皮肤癣菌可在初代培养基中添加,若标本来源广泛,致病菌不仅局限于皮肤癣菌则不能在初代培养中添加。当首先分离到一种真菌后不应丢弃培养基,应当保存至足够时间,以确保没有忽略缓慢生长的真菌。甲培养时建议采用平皿多点培养一J,lO个生长点中有6个为同一种菌则此菌为病原菌。在培养1周内,应该每天观察有无真菌生长。一般培养4周后,如果无真菌生长可报阴性。如果怀疑荚膜组织胞浆菌。培养时间应该延长至68周。发现培养出真菌,直接挑取少量菌体或者小培养后,用乳酸酚棉蓝制成涂片显微镜下观察,结合菌落大体形态,典型菌种

    12、可直接报告种属。不典型菌种根据基本表现,采用适当的标准鉴定培养基,标准培养条件培养,必要时要结合生理学和分子生物学方法进行鉴定。对于某些特殊检测要求,可以在初代真菌培养时采用一些特殊培养基。皮肤癣菌培养基(DTM):皮肤癣菌在SDA上生长需要2至3周甚至更长的时间,耗时长,容易出现霉菌和酵母菌的污染。采用DTM能够较好地克服上述缺点,它通过颜色的改变快速确定皮肤癣菌的存在,一般为34 d,而且培养基含有放线菌酮,能够抑制大部分污染菌的生长0|。这对于皮肤癣菌的培养具有绝对优势。通过该方法的改良能够进一步提高阳性率,适用于较难培养阳性的甲真菌病的诊断。马拉色菌培养基:马拉色菌为嗜油真菌,培养时需

    13、要加入适量油脂。标准培养基是橄榄油培养基,国内有研究者用菜籽油、大豆油、花生油或麻油代替橄榄油也取得了良好的结果,培养的阳性率不低于橄榄油培养基HJ。念珠菌显色培养基(CHROMAgar显色琼脂):不同种类念珠菌菌落颜色不同,可用于鉴定常见的念珠菌,如白念珠菌、热带念珠菌和克柔念珠菌。也可用于初代培养,有研究显示对咽部、尿液和生殖道的标本进行培养,显色培养基培养阳性率高于SDA,并且区分混合感染的能力更强。但是,显色培养基仅能鉴定少数几类常见致病念珠菌,对于不能鉴定的菌种应采用其他方法。四、常见致病真菌的鉴定原则致病真菌中,念珠菌最为常见,已成为引起院内血行感万方数据116 生堡燕殓医堂苤盍兰

    14、Q塑生!旦筮i!鲞筮!翅垡堕垫!坐丛鲤:!坚!翌2鱼塑:!生丝,丛垒!染第4位病原菌;AJDs患者和免疫受损易于发生隐球菌感染;侵袭性曲霉病则主要发生于骨髓移植或急性白血病患者;接合菌感染尽管较少见,但患者病死率高,危害严重。另外,新型少见致病菌感染也越来越多,对真菌鉴定提出了更高要求。以下对常见致病真菌的鉴定原则进行简要介绍。1酵母菌:初代培养基上培养出酵母样菌落,在鉴定前应进行分离纯化。在去除细菌和其他真菌污染,区分混合感染后,对纯菌落进行鉴定。酵母菌鉴定主要根据形态学特征和生理生化特点,按照一定的流程进行。首先根据菌落颜色进行分类。临床最为常见的是白色或奶白色菌落,这类菌进一步做芽管试验

    15、,若芽管试验是阳性则为白念珠菌,若阴性则通过Vitek YBC或APl20C及玉米吐温琼脂上培养的形态特征来鉴定。另外,还可以应用念珠菌显色琼脂、尿素酶试验等试验来辅助鉴定。2霉菌:鉴定非常复杂,有许多标准包括形态学特征、温度耐受性,放线菌酮抗性、双相性、营养需求、蛋白分解活动以及水解尿素能力等。现代分类学鉴定方法主要依据分生孢子的个体发生过程结合其他特征来进行鉴定。初代培养后根据形态学特征一般可鉴定到属的水平,再依据不同真菌的鉴定要求,采用标准培养基和培养条件进一步完成菌种鉴定。例如:皮肤癣菌是根据SDA上形态特点来鉴定,对于不典型菌株需要结合尿素酶试验、营养试验(维生素依赖性)和蛋白水解活

    16、性(BCP-milk培养基)的结果,国内有研究用6种培养基组合而成的改良KaneFisher系统对皮肤癣菌进行鉴定,结果准确,操作简便,可行性高31。曲霉属鉴定时需要采用标准培养基,即察氏培养基和麦芽琼脂,25培养7 d后与曲霉形态鉴定检索表对应得到正确的结果“。真菌感染的检查除经典的真菌学检查法如真菌镜检和真菌培养以外,还包括非培养检查,主要包括血清学检查、真菌特异代谢产物检查和分子生物学检查等。经典检查是真菌检查的基础,尽管存在着敏感度低、耗时长等不足,但因其操作简便而易于推广普及。医学真菌实验室检测方法只有规范化操作才能更好地发挥辅助临床诊断的作用。参考文献1王端礼,李若瑜,王爱平医学真

    17、菌学一实验室检验指南北京:人民卫生出版社,20052吴冰,张少民,马金风透明胶带粘取皮屑直接镜检真菌100例观察中国皮肤性病学杂志,2006,20:1793宋绍业,黄翠波炭素墨水染色检测隐球菌临床检验杂志,2001,19:2174冉玉平检测糠秕马拉色菌的几种取材染色和培养方法介绍中国皮肤性病学杂志。1999,13:1811825安春丽,王本颖,魏会荣检测卡氏肺孢子虫的快速银染法中国寄生虫病防治杂志,1999,12(1):6Weinberg Ji,Koe8tenbm EK。Tutrene WD,et a1Comparisonof diagnostic methods in the evaluat

    18、ion of onychomycosisJ AmAead Dermatol,2003,49:193-1977Aslanzadeh J,Stelmaeh PsDetection of Pneumocystis eariniiwith direct fluorescence antibody and ealcolluor white S切tillInfection,1996,24:248-2508Delvenne P,Arrive JE,Thiry Aet a1 DettioII ofeytomegalovirus,Pneumocystis earinii,and aspergillus spec

    19、ies inbronehoalveolar hvage fluidA comparison of techniquesAm JClin Pathol,1993,100:414-4189阳眉,冉玉平,代哑玲,等多点培养法分离培养150例甲真菌病病原菌中华皮肤科杂志,2005,38:482-48410Taplin D,Zaias N,Rebell G,et a1Isolation and recognition ofdermatophytes on a new medium(DaM)Arch Dermatol,1969,99:203-20911李筱芳,吕桂霞,沈永年,等改良皮肤癣菌试验培养基在甲真

    20、菌病诊断中的应用中华皮肤科杂志,2007,40:473-47512Murray MP,Zinchuk R,Lagone DHCHROMgCandidathesole primary medium for isolation of yeasts and a8 a$ollree mediumfor the rapid-assimilationof-trehalose testJ Clin Microbiol,2005,43:1210-121213王丹,李若瑜,万哲,等改良的KANEFISHER系统对常见皮肤癣菌的鉴定中国真菌学杂志,2006,1:20-2314de Hoog GS,Guarro J

    21、,Gen6 J,et a1Atlas of elineal funsi2ndedUtrecht:Springer Netherlands。2000:442-518思考题(均为单选题)1下列用于真菌检查的标本,取材时应采用钝刀的是:A皮肤组织B毛发C痰D甲E骨髓2用于真菌检查的临床标本大部分都应立即送检,下列哪种标本可以在干燥的环境中保存数日:A毛发B组织c脑脊髓液D血液E分泌物3墨汁染色用于检测下列哪种真菌:A念珠菌B隐球菌C曲霉D马拉色菌E红色毛癣菌4临床标本初代真菌培养选用的培养基是:A皮肤癣菌培养基B念珠菌显色琼脂C含橄榄油的沙氏琼脂D沙氏琼脂或马铃薯琼脂E玉米吐温琼脂5下列哪种方法不是

    22、酵母菌鉴定方法:A玉米吐温琼脂B APl20CC尿素酶试验D芽管试验E温度试验(收稿Et期:200811-25)(本文编辑:武昱史红)本栏目由BD LabO公司协办万方数据医学真菌实验室常规检查方法作者: 余进, 李若瑜作者单位: 北京大学第一医院北京大学真菌和真菌病研究中心,100034刊名: 中华检验医学杂志英文刊名: CHINESE JOURNAL OF LABORATORY MEDICINE年,卷(期): 2009,32(1)被引用次数: 5次参考文献(14条)1.王端礼;李若瑜;王爱平 医学真菌学-实验室检验指南 20052.吴冰;张少民;马金风 透明胶带粘取皮屑直接镜检真菌100例

    23、观察期刊论文-中国皮肤性病学杂志 2006(3)3.宋绍业;黄翠波 炭素墨水染色检测隐球菌期刊论文-临床检验杂志 2001(4)4.冉玉平 检测糠秕马拉色菌的几种取材染色和培养方法介绍 19995.安春丽;王本颖;魏金荣 检测卡氏肺孢子虫的快速银染法 1999(01)6.Weinberg JM;Koestenblatt EK;Tutrone WD Comparison of diagnostic methods in the evaluation ofonychomycosis外文期刊 20037.Aslanzadeh J;Stelmach PS Detection of Pneumocyst

    24、is carinii with direct fluorescence antibody andcalcofluor white stain外文期刊 19968.Delvenne P;Arrese JE;Thiry A Detection of cytomegalovirus,Pneumocystis carinii,and aspergillusspecies in bronehoalveolar lavage fluid.A comparison of techniques 19939.阳眉;冉玉平;代亚玲 多点培养法分离培养150例甲真菌病病原菌期刊论文-中华皮肤科杂志 2005(8)1

    25、0.Taplin D;Zaias N;Bebell G Isolation and recognition of dermatophytes on a new medium (DTM)外文期刊 196911.李筱芳;吕桂霞;沈永年 改良皮肤癣菌试验培养基在甲真菌病诊断中的应用期刊论文-中华皮肤科杂志2007(8)12.Murray MP;Zinchuk R;Larone DH CHROMagar Candida as the sole primary medium for isolation ofyeasts and as a source medium for the rapid-assim

    26、ilation-of-trehalose test外文期刊 2005(3)13.王丹;李若瑜;万哲 改良的KANE/FISHER系统对常见皮肤癣菌的鉴定期刊论文-中国真菌学杂志 2006(1)14.de Hoog GS;Guarro J;Gene J Atlas of clincal fungi 2000本文读者也读过(5条)1. 余进.冀朝晖.李若瑜 常见致病性念珠菌的PCR-RFLP鉴定研究期刊论文-中华皮肤科杂志2002,35(2)2. 赖悦云.鲍立.卢锡京.路瑾.余进.李若瑜.黄晓军.LAI Yue-yun.BAO Li.LU Xi-jing.LU Jin.YU Jin.LI Ruo-

    27、yu.HUANG Xiao-jun 普通血液病房恶性血液病患者念珠菌定植及侵袭性真菌感染的观察期刊论文-中华医学杂志2009,89(4)3. 王辉.陈民钧.WANG Hui.CHEN Min-jun 微生物室与临床密切配合提高肺部感染的病原学诊断水平期刊论文-中华检验医学杂志2009,32(3)4. 马越 抗生素与药物敏感试验期刊论文-中华检验医学杂志2009,32(3)5. 余进.李若瑜.YU Jin.LI Ruo-yu 侵袭性曲霉病的诊断进展期刊论文-中华检验医学杂志2008,31(2)引证文献(5条)1.尹颂超.张云青.谭永芳.杨俊业.黄怀球.李欢.赖维 805例甲真菌病真菌培养结果分析期刊论文-中国真菌学杂志 2013(4)2.陈佩宣 念珠菌快速测定试剂盒的选择期刊论文-检验医学与临床 2011(2)3.陈春华.陈淑勉.赵义刚.雷德龙 酵母样真菌56株的分离鉴定及药物敏感性分析期刊论文-临床和实验医学杂志2010(1)4.齐贺.郑剑玲.王美惠.张中林.耿薇.张伟 口腔黏膜真菌鉴定方法的比较期刊论文-微生物学杂志 2010(3)5.石旭旭.周文.杨文香 含漱不同含漱液后取模对印模细菌及真菌的影响期刊论文-中国组织工程研究 2013(38)引用本文格式:余进.李若瑜 医学真菌实验室常规检查方法期刊论文-中华检验医学杂志 2009(1)

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