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RNA extraction.ppt

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分子生物学实验技术,1.定义2.课程安排:2+4,总RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南,于杨 动脉粥样硬化研究所 副教授 thereismywill@hotmail.com,RNA研究的重要性,DNA,RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子,是生命现象的分子基础。 DNA的遗传信息决定生命的主要性状,而mRNA在信息传递中起很重要的作用。其它两大类RNA,rRNA和tRNA,同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。,RNA分布,在大肠杆菌中,rRNA量占细胞总RNA量的75%-85%,而tRNA占15%,mRNA仅占3-5%。,RNA提取流程-- 样品前处理注意点,,RNA提取流程-- 样品前处理中如何保存样本,RNA提取流程--细胞裂解,以释放RNA,异硫氰酸胍/酚-TRizol总RNA提取试剂,胍盐/β-巯基乙醇—RNAprep系列RNA提取试剂盒,,原理及要点,RNA提取原理:通过变性剂破碎细胞或者组织,然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA,再经过沉淀,洗涤,晾干,最后溶解。但是由于RNA酶无处不在,随时可能将RNA降解,所以实验中有很多地方需要注意,稍有疏忽就会前功尽弃。 RNA提取的一般步骤 所有RNA的提取过程中都有五个关键点,即: 样品细胞或组织的有效破碎; 有效地使核蛋白复合体变性; 对内源RNA酶的有效抑制; 有效地将RNA从DNA 和蛋白混合物中分离; 对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。,最关键的是抑制RNA酶活性。,,,RNA提取的注意事项杜绝外源酶的污染 一:严格戴好口罩,手套。 二:实验所涉及的离心管,Tip 头,移液器杆,电泳槽,实验台面等要彻底处理。 三:实验所涉及的试剂/溶液,尤其是水,必须确保 RNase-Free。,阻止内源酶的活性,一:选择合适的匀浆方法。 二:选择合适的裂解液。 三:控制好样品的起始量。,明确自己的抽提目的,一:任何裂解液系统在接近样品最大起始量时,抽提成功率急剧下降。 二:RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功,而不是得率。,Rnase 污染的10大来源,1:操作者来源:手指头 2:枪头 3:水/缓冲液 4:实验台面 5:内源 RNase 6:RNA 样品 7:质粒抽提 8:RNA 保存 9:阳离子 (Ca2+, Mg2+) 10:后续实验所用的酶,几种RNA提取方法,TRIzol法TRIzol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后,RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后,样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。,TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白,核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质,但不能完全抑制RNA酶活性,因此TRIzol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase(RNA酶)。 0.1%的8-羟基喹啉可以抑制RNase,与氯仿联合使用可增强抑制作用。 异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失,导致细胞结构降解,核蛋白迅速与核酸分离。 β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。,TRIzol法提取流程,1 . 样品处理: (1)培养细胞:收获细胞 1-5×107 ,移入 1.5ml 离心管中,加入 1ml Trizol ,混匀,室温静置 5min 。 (2)组织:取 50-100mg 组织(新鲜或 -70 ℃ 及液氮中保存的组织均可)置 1.5ml 离心管中,加入 1ml Trizol 充分匀浆,室温静置5 min 。 2 .加入 0.2ml 氯仿,振荡 15s ,静置 2min 。 3 . 4 ℃ 离心, 12000g × 15min ,取上清。 4 .加入 0.5ml 异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置 10min 。 5 . 4 ℃ 离心, 12000g × 10min ,弃上清。 6 .加入 1ml 75% 乙醇,轻轻洗涤沉淀。 4 ℃ , 7500g × 5min ,弃上清。 7. 晾干,加入适量的 DEPC H 2 O 溶解( 65 ℃ 促溶 10-15min )。,在抽提RNA前,先把研钵预冷,往研钵内反复加入液氮,至少4-5次,使研钵充分预冷。从液氮罐中取出样本后,把组织块放入已预冷的研钵中进行研磨,边研磨边加液
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