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真菌检测的临床意义.ppt

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真菌检测的临床意义,真菌感染的分类,根据真菌侵犯人体的部位分为四类: 浅表真菌病 皮肤真菌病 皮下组织真菌病 系统性真菌病,,,,,浅部真菌病,深部真菌病,深部真菌感染,深部真菌感染是一种重症感染,死亡率为40-90% 真菌病的发病率呈上升趋势,尤其对重症监护病房和免疫缺陷患者、以及癌症患者,8%的院内感染由真菌引起 白色假丝酵母、热带假丝酵母、光滑假丝酵母、隐球菌等是最常见的感染病原菌 真菌感染的早期诊断、尽早开始治疗,是挽救患者生命的最重要的手段,Company Logo,4,近年深部真菌变迁的特点,念珠菌血症:白色念珠菌为主呈下降趋势非白念:光滑念珠菌,近平滑念珠菌和热带念珠菌,克柔念珠菌呈上升趋势隐球菌、曲菌的比例上升。死亡率增加不同科室的病人发生感染的真菌不同,同一个体内可能发生两种或两种以上的真菌感染产生对氟康唑、两性霉素B的耐药菌株,并有增加的趋势,,近年来,非白色念珠菌的分离率有所上升,全球ARTEMIS Disk研究结果显示: 1997-2003年非白色念珠菌分离率有所升高,分离率(%),MA Pfaller, et al. J Clin Microbiology. 2005:5848-5859.,侵袭性肺真菌感染的流行病学 2005年南京军区总医院30例:曲霉31%,白念24%,光滑念17%,热带念13%,新生隐球菌、克柔念及近平滑念各3% 2002~2006年北京协和医院152例肺真菌感染中确诊38例:曲霉39.5%,隐球菌34.2% 、毛霉10.5%,念珠菌仅5.3% 总之,目前仍以念珠菌感染为主,但发病呈下降趋势,白念减少,克柔念和光滑念增多;曲霉比例逐年增高,可能成为主要病原菌 存在争议,主要因诊断标准不同,国外以组织病理学或组织培养为确诊依据,我国以痰或BALF培养为依据,住院时间长高敏感性 糖尿病 肾衰竭 血液透析急性胰腺炎广谱抗生素的使用中心静脉导管癌症和化疗肠外营养外科手术移植服用免疫抑制剂多处念珠菌定植,ICU中发生侵袭性念珠菌病的危险因素,Luis Ostrosky-ZeichnerCrit Care Med 2006; 34:857–863,ICU患者念珠菌血症的高危因素,一项10年(1990-2000)的回顾性荟萃分析,患者比例(%),Charles PE et al. Intensive Care Med. 2003;29:2162-2169.,临床常见的条件性真菌感染,念珠菌病: 最常见,血源感染的第4位。 曲霉菌病: 常见于干细胞移植、实体器官移植、大剂量化疗患者和免疫缺陷患者。 隐球菌病: 艾滋病人患病率为10-20%。 接合菌病(毛霉病):多见于重症糖尿病、烧伤病及器官移植病人。,临床有增多趋势的条件性真菌,非白念念珠菌感染 毛孢子菌感染 地霉感染 镰刀菌感染 枝顶孢霉感染 暗色真菌感染 马尔尼菲青霉:目前已成为HIV阳性患者的主要条件致病菌,Company Logo,真菌感染的实验室鉴定方法,形态学检查培养+鉴定血清学检查分子生物学检查其它:组织病理学,影像学,真菌直接涂片的诊断价值,诊断阳性率高 BALF培养阳性率40%,涂片64%,涂片+培养67%(Ann Intern Med 1997, 29: 535; Respir Med 1992, 86:243) 快速:2-4h可以报告结果:直接镜检,G染色,墨汁染色 有助于鉴别感染类型 是真菌丝还是假菌丝 有隔菌丝:曲霉菌属 唑类抗真菌药(伊曲康唑、伏立康唑)有效 无隔菌丝: 根毛霉属、根霉属、毛霉属、犁头霉属、小克银汉霉属 两性霉素B敏感,,The lancet, 2003, 3: 230-240,马xx,右下支气管黄曲霉,支气管液,Mucor species - Microscopic Morphology, 400x Lactophenol cotton blue 大型孢子囊,无囊托,无匍 菌丝及假根,真菌培养,结果可靠 可进行分类鉴定到种,可进行药敏试验 无菌部位分离出任何菌株,在未得到可靠证据证明其污染时,不应确诊为污染。 有菌部位来源标本经两次或以上培养为同一结果时,可初步判断为感染菌。,真菌的血清学检测,真菌细胞壁的成分1,3- β- D葡聚糖(G试验):应用范围:曲霉菌、念珠菌、镰刀霉、 毛孢子菌、 (隐球菌、毛霉菌除外) 真菌抗原 半乳甘露聚糖抗原(GM试验)甘露聚糖抗原新型隐球菌的荚膜多糖抗原 真菌特异性代谢产物D-阿拉伯糖醇,真菌血清学检测方法优缺点,优点: 报告结果快速 敏感性高 取样方便 定量检测可判断感染严重程度及疗效评估 缺点:特异性不高,真菌的分子生物学检测方法,PCR方法:一步法PCR、巢式PCR菌种:念珠菌、隐球菌、曲霉菌,重要医学酵母菌分类,医学重要的霉菌分类,1. 监测真菌耐药趋势 2. 为临床选择敏感的抗真菌药物 3. 为合理用药提供快速有效的依据 4. 并有助于临床真菌感染的管理,真菌药敏试验的临床意义,抗真菌药物体外敏感试验,1.液体稀释法CLSI M27A2:致病性酵母菌CLSI M38A: 产孢丝状真菌 2.琼脂稀释法 3.纸片扩散法—— CLSI M44-ARoscoe纸片 4.E-test法,判读难点,拖尾生长 在唑类药物孔中的微弱生长 (得分 = 1 或 2) 导致对 MIC值高估 可能被误判为耐药,,,Control,例如: 在如下所有氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑 孔中都有拖尾生长,1 2 4 8 0.125 0.25 0.5 0.06 0.125 0.25 0.5,16 32 64 128 1 2 4 1 2 4 8,FCA ITR VRC,,,FUNGUS-3的结果判读,对于两性霉素B,最小抑菌浓度(MIC)是得分为“0”时的浓度;对于氟康唑(FCA), 伊曲康唑(ITR)和 伏立康唑(VRC),鉴于可能存在拖尾生长,最小抑菌浓度(MIC)为 得分为“2”,“1”,或是“0”分时的浓度。,,氟康唑, 伊曲康唑, 伏立康唑 : MIC值为得分为“2, 1 或 0”的最小浓度,1 2 4 8,,32 64 128,FCA,判读 唑类 结果,肉眼判读,E-test方法可适合多种真菌的药敏测试,如念珠菌、隐球菌、曲霉菌、镰刀菌、毛霉菌、根霉菌、梨头霉、外瓶霉、帚霉等,E-test检测曲霉MIC,E-test检测念株菌MIC,真菌 E-test 法,纸片扩散法——CLSI M44-A,A,B,,,什么情况下需做体外药敏试验,建议在下列情况下: 1、分离菌株来自血源性感染或其他无菌部位 2、病原为非白念珠菌特别是光滑或克柔念珠菌或者其他霉菌 3、抗真菌治疗疗效不佳 4、拟采用唑类药物进行抗真菌治疗,微生物室如何选择真菌药敏试验,1. 常量稀释法:尽管对真菌药敏试验的标准化起推动作用但日常工作中难推广 2. CLSI纸片法:单个药敏意义不大 3. ATB FUNGUS 3 做真菌药敏试验较为可行。且ATB FUNGUS 3 能提供MIC值。 4. 临床寄希望将来推行Etest 法其是一个很有应用前景的临床实验室抗真菌药敏试验方法。,对 假丝酵母菌属 的结果解释,CLSI 折点:,目前没有官方推荐,文献提供如下信息,对 新型隐球菌 的结果解释,多烯类:两性霉素B、制霉菌素(与麦角固醇结合) 非多烯类:灰黄霉素 唑类药物:1.三唑类药物: 氟康唑、伊曲康唑(抑制麦角固醇合成) 2.咪唑类:酮康唑 丙烯胺类 : 特比萘芬(抑制乙酰辅酶A) 合成抗真菌药物: 5-氟胞嘧啶(阻断核酸合成) 新型抗真菌药物1.第二代三唑类药物 : 伏立康唑 、泊沙康唑2.棘白菌素类: 卡泊芬净、米卡芬净(抑制葡聚糖合成)3.尼可霉素Z (抑制甲壳质合成)4.普拉米星和贝拉米星(抑制甘露聚糖蛋白),临床常用的抗真菌药物,37th热病:抗真菌药物活性,—无活性;+/—可能有活性; +有活性,三线(至少临床有效) ++有活性,二线(作用稍差);+++有活性,一线(常常有效),37th热病:抗真菌药物活性,,—无活性;+/—可能有活性; +有活性,三线(至少临床有效) ++有活性,二线(作用稍差);+++有活性,一线(常常有效),1997-2005 ARTEMIS 念珠菌对氟康唑耐药率变迁,Pfaller MA, et al. JCM. 07:1735.,2001-2005 ARTEMIS 念珠菌对伏立康唑耐药率,Pfaller MA, et al. JCM. 07:1735.,白色 0.8 0.8 1.5 1.0 1.5 1.4 1.6 1.6 1.5 光滑 18.5 22.8 14.3 18.3 14.7 16.9 14.3 15.2 15.8 热带 4.2 3.5 3.1 3.0 6.6 5.0 3.5 3.8 4.4 近平滑 2.0 2.8 2.9 4.2 3.9 3.0 3.3 4.2 3.6 克柔 56.5 71.5 68.1 70.4 78.9 80.2 78.1 79.2 77.8,体外研究中念珠菌对氟康唑的耐药情况,白色、热带、近平滑念珠菌对氟康唑的敏感性仍较好,但是光滑和克柔的耐药率高。,97-98 99 00 01 02 03 04 05 总计,Pfaller. J Clin Microbiol 2005 Pfaller. J Clin Microbiol 2007,1997-2007 ARTEMIS 非念珠酵母菌氟康唑耐药率,Pfaller MA, et al. JCM. 07:1735.,1997-2007 ARTEMIS 非念珠酵母菌伏立康唑耐药率,Pfaller MA, et al. JCM. 07:1735.,,,,,酵母菌敏感性小结,大多数酵母菌对氟康唑敏感性90% 克柔念珠菌对氟康唑类天然耐药,红酵母属氟康唑耐药率约50% 光滑念珠菌耐药率在10~20%,另有~10% SDD 分离自不同标本的念珠菌,敏感性无明显差异 MIC不能完全预测临床疗效, 但是Dose/MIC>25时临床有效率91~99% 念珠菌出现继发感染,患者之前用过三唑类可能耐药 真菌药敏报告提示:“真菌药敏试验结果仅供临床参考”,771株曲霉唑类敏感性,Pfaller MA, et al. JCM. 08: 2568,Hope试验,aspergillus,烟曲霉,黄曲霉,黑曲霉,土曲霉,构巢曲霉,,,,37th热病:抗真菌药物活性,,—无活性;+/—可能有活性; +有活性,三线(至少临床有效) ++有活性,二线(作用稍差);+++有活性,一线(常常有效),37th热病:抗真菌药物活性,,—无活性;+/—可能有活性; +有活性,三线(至少临床有效) ++有活性,二线(作用稍差);+++有活性,一线(常常有效),丝状真菌敏感性小结,烟曲霉:极少有耐药株 黄曲霉:两性霉素B的MICs较高 黑曲霉: 伊曲康唑有耐药菌株 土曲霉:两性霉素B耐药 接合菌: 两性霉素B脂质体对活性较高 接合菌、某些曲霉、暗色真菌:手术切除病灶 严重免疫抑制/低下者,治疗成功需要免疫重建 结合CT、GM、G试验等早期诊断,早期治疗,,体外药敏试验与临床疗效的相关性,念珠菌仍是目前临床最常见的致病真菌,In vitro Susceptibility of Invasive Isolates of Candida spp. To Anidulafungin. Caspofungin, and Micafungin:Six Years of Global Surveillance JOURNAL OF CLINICAL MICROBLOLOGY.JAN.2008.150-156,念珠菌感染具有很高的发病率及死亡率,院内血流感染前4位病原体的分布和死亡率,百分比(%),凝固酶阴性 葡萄球菌,金黄色葡萄球菌,肠球菌,念珠菌,2. Wisplinghoff H et al. Clin Infect Dis. 2003;36:1103-1110.,818/2711,311/2711,230/2711,315/2711,185/553,52/245,84/188,61/228,自1995年至2001年由美国49所医院对2340例院内血流感染患者进行的一项大型前瞻性研究,分析研究院内血流感染最常见的致病菌及其药物敏感性。,早期治疗侵袭性念珠菌感染可降低患者死亡率,11.1%,12小时,12-24小时,24-48小时,48小时,一项对念珠菌血流感染患者进行的回顾性研究结果,院内死亡率(%),*自首次阳性血培养的血标本采集后开始计时 一项自2001年至2004年对157例念珠菌血流感染患者进行的回顾性、队列研究,比较分析开始抗真菌治疗时间与患者死亡率的关系。,4. Morrell M et al. Antimicrob Agents Chemother. 2005;49:3640-3645.,12*小时后平均死亡率为33.1%,P=0.169,早期使用大扶康®可显著降低患者死亡率,12. Kevin W. et al. Clin Infect Dis. 2006; 43:25–31.,死亡率(%),P=0.0009,采集血培养当天*,采集血培养后1天*,采集血培养后2天*,采集血培养后≥3天*,一项4所医学中心对230例念珠菌血症患者进行的回顾性队列研究结果,采集血培养后≥3天开始使用大扶康抗真菌治疗,患者死亡率高达41.4%,41.4%,*自首次阳性血培养的血标本采集后开始计时 自2002年1月至2005年1月,由美国4所医学中心参加的回顾性队列研究,分析230例念珠菌血症患者开始氟康唑治疗的时间与死亡率的关系。,治疗念珠菌感染——2009 IDSA念珠菌病治疗指南,Pappas PG et al. Clinical Infectious Diseases 2009; 48:503-35.,bid:每日2次,治疗念珠菌感染——其他国际权威指南,1. Gilbert DN, et al. The Sanford Guide to Antimicrobial Therapy 2009,,iv:静脉滴注;po:口服给药;qd:每天1次;bid:每天2次。,39版《热病》1,2008 The Medical Letter指南2,2. Treatment Guidelines from The Medical Letter 2008; 65(6).,欧洲系统性真菌感染临床指南(第三版)3,3. Malcolm D Richardson, Brian L Jones. Therapeutic Guidelines Systemic Fungal Infections. Third Edition. Current Medical Literature.,,,,体外抗真菌药敏试验与体内疗效,CLSI M27-A600余株念珠菌MIC值:分离自150余例AIDS的食管念珠菌病,一致性好;治疗失败者,MIC值大于64 µg/ml“90-60原则”—MIC值与临床疗效药敏试验敏感菌株:90%对治疗有效药敏试验耐药菌株:60%对治疗有效Mahmoud A.G, JCM 1996, 34:489-495;Rex J,CID 2002, 35: 982-989,氟康唑敏感性vs.临床有效率,Pfaller MA, et al. CMR. 06: 435.,在临床应用中,常按日剂量与MIC比值大于50的剂量用于严重真菌感染,日剂量与MIC值比值为25的剂量用于一般真菌感染 含MIC的真菌药敏报告对临床治疗更有价值 以FCZ为例:,,Hopenthal et al, Diagn Microb Infect Dis, 2004, 48:153-160,体外抗真菌药敏试验与体内疗效,氟康唑敏感性vs.临床有效率,Pfaller MA, et al. CMR. 06: 435.,Dose/MIC(提示AUC/MIC)25,临床有效率91~99% Dose/MIC 25,治疗失败率26~35%,总 结:,真菌在临床上感染发生的几率越来越高。 临床上对真菌的检测必要时可采用多种方法联合检测以提高阳性率,但培养最重要,不但可以鉴定到种,而且可以进行药敏试验。 总体来说,真菌的耐药没有细菌严重,对大多数抗真菌药物敏感性均较高。但念珠菌中应注意克柔和光滑念珠菌的耐药性,棘白霉素类不能用于隐球菌感染治疗,丝状真菌应区分曲霉菌和非曲霉菌的治疗。 微生物室真菌药敏报告可能与临床疗效存在一定的差别,但药物的MIC值对治疗药物剂量的选择有帮助。 大扶康®作为防治念珠菌感染的首选,抗菌活性强,耐药率低。,,谢 谢!,
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