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质粒DNA的提取与鉴定20100604.ppt

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质粒DNA的提取与鉴定20100604.ppt
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质粒DNA的提取、定量 酶切与PCR鉴定,http://jpkc.fimmu.com/sfzx/,南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 Expertimental Teaching Center of Biochemistry and Molecular Biology,余海浪 E-mail:geneyu1717@126.com,实验内容,提取原理 操作步骤,原理体系 引物设计,计算方法 操作步骤,,,,,,,,,,,,,,,,,,PCR,质粒DNA,定量,酶切原理 酶切步骤,,,,,,,酶切,,电泳原理 电泳步骤,,,,,,电泳,PCR技术的方法,,PCR操作、上机,,1. PCR原理 2. 质粒DNA提取原理 3. 质粒DNA操作步骤 4. 紫外检测定量知识 5. 酶切原理、操作步骤 6. 琼脂糖电泳原理及步骤 7. 凝胶成像系统,,质粒DNA的提取,,,酶切分析,质粒定量,,琼脂糖凝胶电泳,,,,实验流程,实验目的,掌握碱裂解法提取质粒的方法 了解紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理、方法 学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作 掌握PCR基因扩增的原理和操作方法,,第二部分 质粒DNA提取与定量Extraction and Quantitation of Plasmid DNA,独立于细菌染色替外,能独立自主复制的闭合环状DNA分子;存在于细菌,放线菌,真菌以及一些动植物细胞中,在细菌细胞中最多.,质粒(Plasmid),定 义,碱裂解法 煮沸裂解 羟基磷灰石柱层析法 质粒DNA释放法 酸酚法等,方 法,选择哪一种方法主要取决以下几个因素:质粒的大小 大肠杆菌菌株 裂解后用于纯化的技术和实验要求,分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤: 培养细菌使质粒扩增; 收集和裂解细菌; 分离质粒DNA,,分离质粒DNA三步曲,,,,,,分离 质粒,,,,,,收集 裂解 细菌,,,,,,质粒 扩增,基本步骤,,基本原理,,1、碱裂解法,基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异;,高碱性条件下,染色体DNA和质粒DNA变性;,当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时,变性的质粒DNA复性并保存在溶液中,染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心形成沉定去除;,2、离心层析柱,基本原理,硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA;去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除;低盐,高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱;,原理示意图,(一)仪器:恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅 (二)材料:含pMD18-T质粒的大肠杆菌DH5α (三)试剂: LB培养基(液体、固体) Bioteke质粒提取试剂盒(北京百泰克,中国),溶液 P1 溶液 P2 溶液 P3 去蛋白液 PE 漂洗液 WB 洗脱液 EB,仪器材料,50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L Tris·Cl(pH8.0) 10 mmol/L EDTA (pH8.0)作用:分散细胞,鳌合金属离子使金属酶失活注意:菌液一定悬浮均匀,不能有结块,溶液 I,0.2 mol/ L NaOH 1% SDS作用:细胞壁肽聚糖在碱性下水解,核酸和蛋白质变性。注意:时间勿太久,动作要温柔,轻轻颠倒几次,溶液 II,5mol/L 乙酸钾 60 ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml作用:酸性条件下质粒DNA复性,变性蛋白-SDS+线性DNA沉淀,Na+可中和DNA注意:复性时间不宜过长,溶液 III,菌液,,离心13000rpm,1min,弃上清,,瞬时离心,彻底弃上清,,加250μl 溶液P1,,旋涡振荡,悬浮沉淀,加250μl 溶液P2,,加400μl 溶液P3,颠倒数次,放置3-5min,,离心13000rpm,10min,,取上700μl加到吸附柱中,,离心,13000rpm,1min,弃滤液,加入500μl去蛋白液,,13000rpm,1min,离心,(1),(2),(3),(4),(5),(6),(7),(8),(9),弃滤液,加入500μl漂洗液WB,(10),离心,13000rpm,1min,,弃滤液,加入500μl漂洗液WB,(11),离心,,13000rpm,1min,弃滤液,(12),空柱离心,13000rpm,2min,,放入一个干净的离心管中(开盖放置3min),在吸附膜的中间加60μl洗脱液EB(放置1min),离心,,13000rpm,1min,(13),-20℃保存备用,操作步骤,,,,,,,,,,,,颠倒数次,紫外光吸收法,原理:1,物质在光的照射下会产生对光的吸收效应 2,而且物质对光的吸收是具有选择性的3,各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱,因此不同波长的单色光通过溶液时其
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