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实时荧光定量pcr原理及引物设计.ppt

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实时荧光定量pcr原理及引物设计.ppt
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逆转录-实时荧光定量PCR(RT-)qRT-PCR,,(RT-)qRT-PCR (Reverse transcription) quantitative real time PCRRT-PCR Reverse transcription-PCR Real-time PCR,样品处理,细菌样品 收集1-5*109细菌,置于液氮 研磨,加入1mL Trizon,混匀,高温(55℃)细胞样品 收集1-5*107细胞,加入1mL Trizol,混匀,进行RNA提取或者放置于-80℃冰箱动物样品 取50-100mg组织(新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可)置1.5 mL离心管中,加入1ml Trizol充分匀浆。,RNA提取及反转录,将处理好的样品置于室温,静置5 min 加入0.2mL氯仿,振荡15s,静置5 min 4℃离心,12000g×15min,取上清 加入等体积异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置10min 4℃离心,12000g×10min,弃上清 加入1ml 75%乙醇,轻轻洗涤沉淀。4℃,7500g×5min,弃上清 晾干,加入适量的DEPC H2O溶解(65℃促溶10-15min)。,RNA提取及逆转录,注意事项 样品量和Trizol的加入量一定要按比例,不能随意增加样品量或减少Trizol量,否则会使内源性RNase的抑制不完全,导致RNA降解。 实验过程必须严格防止RNase的污染。 DNase (RNase-free) RRI (Recombination RNase Inhibitor),,,RNA提取及逆转录,RNA质量检测(完整性与纯度),RNA提取及逆转录,反转录注意事项RT Primer的选择 Oligo dT,随机引物,基因特异性引物gDNA污染,RNA提取及逆转录,❌,qRT-PCR(实时荧光定量PCR),与常规PCR技术比较 常规PCR对扩增终产物进行定量和定性分析,无法对起始模板准确定量,无法对扩增反应实时监测。,qRT-PCR的化学原理,qRT-PCR的化学原理,起点定量:起始DNA量是样本中原来的DNA量,更有意义,重现性好,误差小。 终点定量:终点DNA的量是经过PCR放大的量,存在部分“失真”,并非研究所期望的数据,误差大。,qRT-PCR的化学原理,典型的PCR扩增四个阶段,qRT-PCR的化学原理,三个概念 基线(Baseline):是指在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大。接近一条直线,这样的直线即是基线。 荧光域值(threshold)的设定:一般将 PCR反应前 15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值是PCR 3-15个循环荧光信号标准差的10倍,荧光域值设定在 PCR扩增的指数期。,qRT-PCR的化学原理,三个概念 Ct值:C(Cycle),t(threshold)表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明,各模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表Ct值。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,qRT-PCR的数学原理,在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得:log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) log(1+Ex) *Ct= -log X0 + log M (4) Ct= -log X0 + log M (5)log(1+Ex) Log(x0的初始模板量)与到达阈值时的循环数(Ct值)呈线性关系,根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量,qRT-PCR的数学原理,qRT-PCR的标记方法,qRT-PCR的标记方法,非特异性荧光标记 SYBR Green Ⅰ是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的原料。,qRT-PCR的标记方法,非特异性荧光标记 SYBR Green I作用原理,qRT-PCR的标记方法,非特异性荧光标记 SYBR Green I标记注意事项SYBR Green I与任何dsDNA进行结合后散发荧光,因此如果反应体系中有非特异性扩增或者引物二聚体的生成,也将同时被检测,从而导致检测结果不准确。 设计合适引物,防止非特异性扩增。 反应结束后必须做熔解曲线分析。,qRT-PCR的标记方法,非特异性荧光标记 熔解曲线 对PCR产物
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