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感染性疾病分子诊断2013.ppt

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感染性疾病分子诊断2013.ppt
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分子诊断学,,陈昌杰,病因 内因和外因两大类内因主要指遗传因素,如基因结构、基因表达状况的改变,其中基因结构的改变包括点突变、插入、缺失、重排、易位、基因结构多态性变异、前病毒插入等;而基因表达状况改变则包括转录产物的结构或表达量的异常。外因是指外在的环境因素,如生活方式、工作环境、精神状况和各种感染性病原体的侵入等。,第十章 感染性疾病的分子诊断分子诊断(molecular diagnosis)是指通过检测基因的结构异常或其表达异常,对人体的健康状态和疾病作出诊断的方法。评估基因的存在和缺陷通常以DNA为材料,而评估基因的表达量则以基因转录或翻译的产物RNA/蛋白质分析来评估个体的生理/病理状态。,分子诊断技术主要包括 核酸杂交 聚合酶链式反应(PCR) 基因芯片技术,感染性疾病即由病原微生物引起的疾病的统称 。外源性感染:指由外界致病病原体侵人人体后导致的感染,如伤寒、病毒性肝炎等多为外源性感染。 内源性感染:指由人体自身的正常菌群,在人体免疫功能下降时引起的感染,因为这些细菌必须在一定条件下才能致病,所以又称为条件致病菌或机会致病菌,如肠道菌群中的大肠埃希菌、肠球菌等引起的感染多为内源性感染。,分子诊断对感染性疾病可用于以下几个方面:适用不易培养的;种属鉴定;早期诊断;动态监测;流行病学调查;基因分型;耐药检测。,感染性病原体进行分子诊断,取决于两个条件: 一是在该病原体核酸中有特异的核酸序列(感染性病原体本身含有一些保守序列,即使在不同的基因型这些保守序列的变异也很小,因此可以根据保守序列设计探针或引物); 二是能够根据特异的核酸序列设计和制备具有特定信号的探针或设计合成相应PCR引物,多数感染性疾病的病原体都具备上述两个条件。,诊断策略可以分为以下两种:一般性检出策略 完整检出策略,一般性检出策略所提供的感染性病原体的信息量较少,几乎不提供型别(包括变异株)和耐药性方面的信息 ,因此,对于感染感染性疾病分子诊断一般性策略只是快速诊断是何种病原体的感染。,为了得到更多的疾病病原体信息,建议应该采取完整策略按照诊断→分型→亚型→耐药性检测的思路,利用多种分子诊断手段对感染性病原体进行分析。,第一节 病毒的基因检测人类许多感染性疾病由病毒引起,如肝炎、脑炎、脊髓灰质炎、流行性感冒、狂犬病、艾滋病等。根据病毒的核酸成分,可将其分为脱氧核糖核酸(DNA)病毒和核糖核酸(RNA)病毒两大类。,一、乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是引起病毒性肝炎的主要病原体之一,属嗜肝DNA病毒科的原型病毒,病毒毒粒中含内源性DNA聚合酶活性。嗜肝病毒科有独特的复制方式,病毒合成以RNA中间体为模板,经反转录合成DNA链,在某些方面,HBV与逆转录病毒有许多相似性。,乙型肝炎病毒( HBV) 感染是一个严重的全球问题,据估计全球大约有20 亿人曾经感染乙肝病毒, 慢性HBV感染者约315 亿~ 4 亿人, 每年有50 万~ 120 万人死于HBV 感染。我国是乙型肝炎的高发区, 每年约有10% ~20%的急性乙肝将转成慢性肝炎, 肝硬化甚至发展成肝癌,严重威胁着人们的健康, 急性乙肝的慢性化及慢性肝炎癌变的发生机制是多年来肝病研究的重点。,HBV 感染的病原学诊断 免疫血清学检测 HBV 的血清学标志物 分子生物学方法检测免疫学方法测定病毒抗体是一种快速简便的检测手段, 常用的方法是间接ELISA, 目前我国HBV 检测采用的第三代ELISA 试剂由多种病毒抗原组合匹配, 具有较好的灵敏性和特异性, 但其在病毒感染的窗口期不能检测到抗体, 这在很大程度上限制了ELISA 检测的准确性, 不能有效的控制病毒的传播, 因而, 发展新的诊断HBV 感染主要依赖分子生物学技术对病毒DNA 的检测。,(一)病毒基因组结构HBV是一种可感染人体、且具有独立复制能力的双链DNA病毒,具有以下几个特点:① 不完全双链环状结构;② 利用重叠的开放读码框架(ORF)可编码多个蛋白质;③ 所有调控序列均位于蛋白质编码区;④ 基因序列具有多变性。HBV基因组是已知可感染人类又能独立进行复制的双链DNA病毒中最小和最高效的。,HBV基因组具有独特的结构,是一个长约3.2 kb的不完全双链环状DNA。双链的长度不对称,长链(L)因与病毒mRNA互补,定为负链;短链(S)为正链,5’末端固定,3’末端位置不固定,S正链的长度可为L负链的50~100%,因而在病毒群体中出现不同长度的正链与全长的负链匹配,故仅有部分基因组长度为双链。HBV基因组L链上至少有4个ORF,分别称为S、C、P和X,编码外膜蛋白、核壳蛋白、聚合酶和X蛋白。多个ORF重叠的结果使HBV本身3.2 kb基因组序列的利用率高达150~200%。,(二)分子诊断方法1.PCR 2. 支链DNA技术 3. 核酸杂交 4. 基因芯片技术,逆向斑点杂交法原理就是将各种探针固定在基质上, 用以检测受检的各种标记样品中与探针互补的核酸物质的变化。,FeO/ Au 纳米颗粒探针法近年来, 通过纳米表面结合寡核苷酸构成纳米颗粒基因探针, 用于检测靶脱氧核糖核酸。其原理是利用DNA 碱基严格互补配对的特性设计的, 主要应用于分子的组装。,聚合酶链反应- 限制性片段长度多态性法该法利用错配PCR 的原理扩增HBV 前C 区长194 bp,C 启动子区长184 bp 的基因片段, 扩增产物分别经限制性内切酶Bsu 361, Bc1I 酶切, 琼脂糖凝胶电泳, 根据酶切图谱多态性, 建立检测HBV 前CA1896, BCPT1762/ A1764双变异的方法,,乙型肝炎病毒DNA 等温扩增技术 HBV 的病毒载量与感染状态密切相关, 寻求快速、简便、灵敏、特异的定量手段是对HBV 早期诊断、病程监控及流行病学调查的需求。,(三)临床意义 1.HBV感染的早期诊断2. 监测治疗效果3. 判断病情,指导制订合理的治疗方案 HBV DNA定量检测是判断病毒复制情况的指标。HBV DNA拷贝数越高,病毒复制越厉害,传染性越强,肝脏病理损害程度越高,肝组织炎症反应越重。 4. 在乙型肝炎病毒耐药检测中的应用,HBV DNA 检测是乙肝病毒抗病毒治疗的有效监测指标。乙肝病毒药物治疗后, HBVDNA 含量持续下降, 然后持续在低水平, 或低至方法学能检出的含量( 测定下限)以下, 则说明治疗有效。观测抗病毒药物治疗效果不能凭两三次检测结果来判断, 必须多次动态观察, 每次检测的间隔天数不宜太短, 一般为两周以上。可采用以检测次数为横坐标, HBV DNA 量为纵坐标作图的方法来判断血清HBV DNA 量的变化趋势, 进而判断抗病毒治疗是否有效。血循环中HBV DNA 浓度与HBsAg 和HBeAg 有一定的相关, 但其浓度间并不呈正线性相关。,拉米夫定作为新一代核苷类高效抗乙肝病毒药物,可迅速降低HBV-DNA的浓度,改善肝脏组织的病变,还可能阻止纤维化的进程,终止肝硬化的发展,尤其是拉米夫定不受人种、病毒感染的模式、野生型或基因组前C区突变的影响。该药与干扰素合用有协同作用。,长期服用拉米夫定会引起HBV基因突变而造成耐药,其中95%是由于HBV基因组P区中高度保守的YMDD功能区(Y酪氨酸—M甲硫氨酸—D天冬氨酸-- D天冬氨酸)发生突变:第552位甲硫氨酸(M)被缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)代替,突变后的HBV称为YVDD变异株和YIDD变异株。由于变异造成基因组核苷酸与DNA多聚酶的结合能力有降低,通常变异株的复制能力低于野生株。当停止应用拉米夫定治疗后,野生株通常会替代变异株。,HBeAg 阳性的标本,HBV DNA 通常有较高的浓度, HBeAg 阴性、抗HBe 阳性的标本, HBV DNA 浓度通常较低。当HBV 基因组前C 区发生突变时, 则可出现HBeAg 阴性而HBV DNA 仍保持在较高的浓度。单独抗HBc 阳性的血液HBVDNA 浓度通常很低。,关于血液中HBV DNA 浓度与患者传染性之间的关系, 如血清中HBV DNA 浓度大于109 拷贝/ ml, 则在日常生活密切接触中即具有较强的传染性。105~ 106 拷贝/ ml,则在日常生活密切接触中的传染性较小。小于105 拷贝/ml, 则日常生活密切接触中几乎没有传染危险性。但不管HBV DNA 的浓度为多少, 哪怕是低于相应PCR 方法的下限, 也均会引起输血后的感染。,基因分型方法,一种在临床上准确、快速、简便地对乙型肝炎病毒进行基本分型( BCD) 的方法, 该方法通过大量分析已分型的HBV 基因组序列, 寻找出HBV 各基因型的型特异性硷基的分布规律, 设计型特异性的引物和探针, 利用已知全序列HBV 建立荧光PCR 是目前最灵敏的检测方法之一, 检测极限可达到100 copise/ ml的DNA 浓度。,二、丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)属黄病毒科。目前发现约90%的输血后非甲非乙型肝炎和7080%的无输血史的散发型非甲非乙型肝炎由HCV感染所致。部分HCV感染者不出现临床症状,但有50%会发展成为慢性,且易致肝硬化和肝癌。HCV主要通过输血感染(是输血后肝炎的主要致病因子),也可由静脉注射或母婴和家庭内接触而获得。,(一)病毒基因组结构丙型肝炎病毒呈球形颗粒,直径约50nm,有一脂质包膜。核心含单股正链RNA,长9.4 kb。整个基因组只有一个可读框,位于基因组中央,编码一条含有,RNA病毒中的RNA能自我复制,大部分RNA病毒是单链的,复制一般是先以自己为模板合成一条互补的单链,病毒原有的、起模板作用的链称为正链,新复制的RNA链称为负链。,,,,,,(二)分子诊断方法 1.PCR 2. 核酸杂交 3. bDNA技术 4. 基因芯片技术,1. 定性检测 虽然抗HCV并不是保护性抗体,临床上可以根据抗HCV来判断是否感染,但由于患者免疫功能的差异,仅有部分患者出现抗HCV,且抗HCV尚会出现时阴时阳的表现。采用分子生物学技术检测到HCV RNA的存在是HCV感染的确证标志。检测HCV-RNA可对丙型肝炎作早期诊断,解决了免疫学检测的“窗口期”问题,可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。在HCV的感染中,第一周内就可以检测出HCV RNA,,2. 定量检测 可判断HCV的传染性及病毒复制情况,进行病情评估、判断病人预后。还可通过对HCV RNA拷贝数的监测,评价干扰素和其他抗病毒药物的疗效。另外,人们注意到临床分型与疗效的关系,发现如III型HCV患者对干扰素的疗效更佳,此时也需要采用分子生物学技术对HCV进行病毒分型。,三、人类免疫缺陷病毒人类免疫缺陷病毒HIV),顾名思义它会造成人类免疫系统的缺陷。1981年,人类免疫缺陷病毒在美国首次发现。它是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒,属反转录病毒的一种。至今无有效疗法的致命性传染病。该病毒破坏人体的免疫能力,导致免疫系统的失去抵抗力,而导致各种疾病及癌症得以在人体内生存,发展到最后,导致艾滋病(获得性免疫缺陷综合症)。,人类免疫缺陷病毒是艾滋病的病原体,自1983年首次分离出第一株HIV以来,现已发现引起艾滋病的病毒有HIV-1、HIV-2、HIV-3等3种。,在感染后会整合入宿主细胞的基因组中,而目前的抗病毒治疗并不能将病毒根除。病毒基因变化多样;广泛存在于感染者的血液、精液、阴道分泌物、唾液、尿液、乳汁、脑脊液、有神经症状的脑组织液,其中以血液、精液、阴道分泌物中浓度最高;对外界环境的抵抗力较弱,对乙肝病毒有效的消毒方法对艾滋病病毒消毒也有效;感染者潜伏期长、死亡率高; 病毒基因都复杂。,体外生存 人类免疫缺陷病毒在人体外生存能力极差,不耐高温,抵抗力较低,离开人体不易生存,常温下只可生存数小时至数天。 HIV对热敏感。在56℃条件下30分钟即失去活性,但在室温保存7天,仍保持活性。 灭活方法,不加稳定剂病毒在-70℃冰冻下失去活性,而35%山梨醇或50%胎牛血清在-70℃时冰冻3个月仍保持活性。对消毒剂和去污剂亦敏感,0.2%次氯酸钠、0.1%漂白粉、70%乙醇、35%异丙醇、50%乙醚、0.3%H2O20.5%来苏尔处理5分钟能灭活病毒,1%NP-40和0.5%triton-X-100能灭活病毒而保留抗原性。对紫外线、γ射线有较强抵抗力。,国际卫生组织推荐对艾滋病病毒灭活加热100℃持续20分钟,效果较理想。艾滋病病毒的消毒主要是针对被艾滋病病毒感染者和艾滋病病人的血液、体液污染的医疗用品、生活场所等。例如,辅料、纱布、衣物等。对艾滋病病毒的消毒可以根据消毒物品选择适当的物理方法或化学方法。需要重复使用的物品可用煮沸或高压蒸汽消毒。不宜煮沸的物品可用2%戊二醛、75%酒精等进行消毒。,体液生存 在室温下,液体环境中的HIV可以存活15天,被HIV污染的物品至少在3天内有传染性。 近年来,一些研究机构证明 ,离体血液中HIV病毒的存活时间决定于离体血液中病毒的含量,病毒含量高的血液,在未干的情况下,即使在室温中放置96小时,仍然具有活力。即使是针尖大小一滴血,如果遇到新鲜的淋巴细胞,艾滋病毒仍可在其中不断复制,仍可以传播。,病毒含量低的血液,经过自然干涸2小时后,活力才丧失;而病毒含量高的血液,即使干涸2-4小时,一旦放入培养液中,遇到淋巴细胞,仍然可以进入其中,继续复制。 所以,含有HIV的离体血液可以造成感染。尽管艾滋病毒见缝就钻,这些病毒也有弱点,它们只能在血液和体液中活的细胞中生存,不能在空气中、水中和食物中存活,离开了这些血液和体液,这些病毒会很快死亡。,形态结构 人类免疫缺陷病毒直径约120纳米,大致呈球形。病毒外膜是类脂包膜,来自宿主细胞,并嵌有病毒的蛋白gp120与gp41;gp41是跨膜蛋白,gp120位于表面,并与gp41通过非共价作用结合。向内是由蛋白p17形成的球形基质,以及蛋白p24形成的半锥形衣壳,衣壳在电镜下呈高电子密度。衣壳内含有病毒的RNA基因组、酶(逆转录酶、整合酶、蛋白酶)以及其他来自宿主细胞的成分(如tRNAlys3,作为逆转录的引物)。,(一)病毒基因组结构HIV属逆转录病毒科,该科病毒带有以RNA为模板合成DNA的逆转录酶。HIV颗粒的核心有两个拷贝的单股正链RNA,两个单体通过5’末端的氢链结合形成二聚体。每个RNA的长度约为9.7kb。,两端是长末端重复序列(long terminal repeats, LTR),含顺式调控序列,控制前病毒的表达。已证明在LTR有启动子和增强子并含负调控区。LTR之间的序列编码了至少9个蛋白,可分为叁类:结构蛋白、调控蛋白、辅助蛋白。 1.gag基因能编码约500个氨基酸组成的聚合前体蛋白,经蛋白酶水解形成P17,P24核蛋白,使RNA不受外界核酸酶破坏。 2.Pol基因编码聚合酶前体蛋白,经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶、核糖核酸酶H,均为病毒增殖所必需。,3.env基因编码约863个氨基酸的前体蛋白并糖基化成gp160,gp120和gp41。gp120含有中和抗原决定簇,已证明HIV中和抗原表位,在gp120 V3环上,V3环区是囊膜蛋白的重要功能区,在病毒与细胞融合中起重要作用。gp120与跨膜蛋白gp41以非共价键相连。gp41与靶细胞融合,促使病毒进入细胞内。实验表明gp41亦有较强抗原性,能诱导产生抗体反应。,4.TaT 基因编码蛋白可与LTR结合,以增加病毒所有基因转录率,也能在转录后促进病毒mRN A的翻译。 5.Rev基因产物是一种顺式激活因子,能对env和gag中顺式作用抑制序(Cis-Acting repression sequance,Crs) 去抑制作用,增强gag和env基因的表达,以合成相应的病毒结构蛋白。,.Nef基因编码蛋白P27对HIV基因的表达有负调控作用,以推迟病毒复制。该蛋白作用于HIv cDNA的LTR,抑制整合的病毒转录。可能是HIV在体内维持持续感集体所必需。 7.Vif基因对HIV并非必不可少,但可能影响游离HIV感染性、病毒体的产生和体内传播。 8.VPU基因为HIV-1所特有,对HIV的有效复制及病毒体的装配与成熟不可少。,9.Vpr基因编码蛋白是一种弱的转录激活物,在体内繁殖周期中起一定作用。 HIV-2基因结构与HIV-1有差别:它不含VPU基因,但有一功能不明VPX基因。核酸杂交法检查HIV-1与HIV-2的核苷酸序列,仅40%相同。env基因表达产物激发机体产生的抗体无交叉反应。,自1985 年, 美国食品药品监督管理局批准使用第一代酶联免疫吸附试验( ELISA) 检测试剂以来, HIV 的诊断得到了快速发展, 现已从以前的单纯H IV 抗体检测, 发展到现在的抗原、核酸、CD4+ 、CD8+ 淋巴细胞计数、基因芯片技术等方法, 大大缩短了检出窗口期, 提高了检出率。,近年来, 随着分子生物学技术的快速发展, 应用分子生物学技术检测H IV 的核酸已经成为H IV 实验室诊断的重要发展方向。 核酸检测技术主要用于被高度怀疑有原发感染, 且经抗体检测之后抗体检测阴性或不确定时; 有高危行为或暴露史, 特别是伴有相应临床表现时, 早期诊断主要用于个体检测、 血液筛查、H IV 阳性产妇的婴儿诊断 。,原位杂交技术􀀁 应用特定的标记探针以分子杂交法直接检测样品中的H IV 病毒靶核酸, 初期为放射性标记, 现在多以酶标记或化学发光试剂标记。,HIV 核酸定性检测􀀁 最常用的技术是聚合酶链反应( PCR) 和逆转录PCR( RT- PCR) 能在HIV 感染1~ 14 d 的患者血浆中检测到H IV RNA, 可用于急性感染患者、抗体检测不确定等情况的辅助诊断或用于血液筛查, 使HIV 感染窗口期缩短至2 周以内。,尤其在H IV 阳性母亲产下的婴儿是否感染H IV 的诊断中有着非常重要的意义, 前病毒DNA PCR 检测法对出生48 h 内的婴儿检测敏感性为38%,出生2 周的婴儿检测敏感性达93%。,H IV 核酸定量检测 目前HIV 核酸定量检测技术主要有RT- PCR、分支DNA 信号扩大系统( bDNA) 、核酸序列依赖的扩增系统、转录介导的扩增系统( TMA) 。,基因芯片检测技术 该技术起始于20 世纪90 年代, 通过对H IV基因组分析, 将病毒的高度保守序列作为鉴定指标, 将这些特定的寡核苷酸片段作为探针, 有规律地排列于固相支持物上,然后与待测的标记样品的基因进行杂交, 经过计算机系统进行分析得出结果, 后来应用到H IV 实验室检测。,HIV 的实验室检测正朝着早期、快速、敏感、准确、自动化方向发展, 相信不久的将来, 一些新的技术会逐步应用到这一领域, 使H IV 的诊断和治疗技术又上一个新的台阶。,临床意义: 早期诊断 婴儿诊断 疗效评价 了解疫情,第二节 病原菌的基因检测细菌广泛分布于自然界。在人的体表和与外界相通的口腔、鼻咽腔、肠道、泌尿生殖道等存在着不同种类和数量的细菌。人体免疫功能正常时,某些寄居在正常人体的细菌对人无害,属于正常菌群。正常菌群与人体之间的平衡受某些条件的破坏可导致疾病,此时这些细菌为条件致病菌。另一些细菌因其本身所具有的毒性及侵袭力,一旦进入人体将会造成人体的感染,统称为病原菌。,病原菌的诊断方法有直接涂片镜检、分离培养、生化试验、血清学试验和动物试验等,但由于细菌培养周期较长等种种原因,尚不能令人满意。分子诊断技术的应用将使细菌感染的诊断出现一个质的飞跃,同时可将分子诊断技术用于细菌分型、耐药性的检测中。,一、淋球菌淋球菌(gonococcus)又名淋病耐瑟氏菌(neisseria gonorrhoeae, NG),是淋病的病原菌。,(一)细菌基因组结构 淋球菌染色体可编码约5000个基因,仅为大肠埃希菌基因组的1/3,其G+C含量为52%。 (二)分子诊断方法 1. PCR 2. LCR 可采用连接酶链式反应(ligase chain reaction, LCR)检测淋球菌DNA。,(三)临床意义 1. 对分离培养的菌株进行鉴定和进一步分析。 2. 用于抗生素治疗的疗效观察及监控。 3. 提高临床标本检测的阳性率和准确性。 4. 对淋球菌菌株进行分子流行病学分析。 5. 对疑为淋球菌引起的疾病的诊断和鉴别诊断具有决定性作用。,结核分枝杆菌,结核分枝杆菌1882年由Robert Koch发现,对人致病的主要是人型结核分枝杆菌,引起结核病。伴随艾滋病的流行、免疫抑制剂的应用等,结核病发病率逐年上升,免疫低下个体特别是HIV感染者更易于感染结核分枝杆菌。尽管存在有效短程化学疗法和卡介苗接种等方法防治,TB仍然是威胁人类生命最严重的感染性病原。1993年,WHO宣布结核病是一个全球性危机。,目前临床上常用的结核病诊断方法有细菌学涂片抗酸染色、活检病理诊断和体液或组织培养。细菌学涂片和活检病理抗酸染色找到抗酸杆菌可以确诊结核,但是阳性率很低,而且不能区别结核杆菌和不典型结核杆菌。另外麻风杆菌也可以表现为抗酸染色阳性。体液或活检组织的分枝杆菌培养阳性可明确诊断结核及菌型,但是培养时间长,且阳性率非常低。虽然新的培养法BACTEC 法显著缩短了培养、菌型鉴定结果的报告时间,但由于该法使用放射性底物而使它的应用受到了限制。并且有些类型分枝杆菌不能在培养基中生长。,结核病的历史,态生两靥之愁 娇袭一身之病,结核病2006年全世界流行分布情况,1882年3月24日,罗伯特.科赫( Robert Koch )宣布发现结核杆菌-----世界防治结核病日,结核杆菌,结核杆菌,结核分枝杆菌(M.tuberculosis),生物学主要特点: 1.结核分枝杆菌细胞壁中含有大量脂质 2.引起的疾病都呈慢性,并伴肉芽肿 3.抗酸染色阳性,抵抗力 四 怕 乙醇 湿热 紫外线 抗结核药物四不怕 干燥 酸碱 碱性染料 青霉素等抗生素,致 病: 致病物质 脂质①索状因子②磷脂③硫酸脑苷脂(sulfatide)④蜡质D蛋白质多糖,感染方式呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入机体所致疾病疾病种类多样化以肺结核为主,1、直接涂片镜检,传统的微生物检查,2、浓缩集菌,传统的微生物检查,3、分离培养,传统的微生物检查,分子生物学快速诊断,TB H37Rv株的基因组为环形DNA。 0点表示复制起始点。 最外层代表稳定的RNA基因和直接重复区 第二层示线性编码序列 第三层描述了重复DNA 第四环标出了PPE家族的位置 第五个环标出了PE家族的位置 第六个环标出了PGRSs序列的位置 最中心的直方图表示了G+C含量,基因结构,可采用PCR、FQ-PCR、竞争性PCR、免疫杂交PCR等方法检测标本中的TB DNA。 PCR扩增所选靶序列主要有65000抗原基因、MPB蛋白基因、tRNA基因、TBIS110插入序列、染色体DNA的重复序列等。 扩增产物可用核酸杂交法进一步鉴定产物的特异性。,分子诊断,应用PCR方法检测结核杆菌的首要条件是设计一对特异性DNA引物.另外几个关键因素是: ①DNA提取 ②TaqDNA聚合酶的活性 ③PCR产物的检测方法,分子诊断,,,,现在主要的细菌裂解方法是: ①蛋白酶K加表面活性剂法; ②蛋白变性剂加表面活性剂煮沸法; ③反复冻融法; ④超声波法; ⑤溶菌酶加表面活性剂法. DNA的提取方法主要有酚提取法和玻璃棒缠绕法,一、结核杆菌DNA的提取,技术步骤,,根据不同型结核杆菌的序列,目前常在下列几种序列内进行引物设计.常用的引物有: 1、IS6110插入序列:仅见于MTBC.这种插入序列在基因组中的拷贝数为1--20个,选择插入序列作为扩增的靶序列,可以得到较高的敏感性和特异性.尤其是IS6110,是目前进行临床PCR检测的首选区段. 2、16SrRNA序列 3、DNA重复序列,二、引物的设计,技术步骤,,三、PCR产物的检测方法,通常PCR产物的检测方法是经琼脂糖电泳后,用溴化乙锭染色,然后在紫外灯下观察或进一步采用标记的DNA探针杂交. 为了进一步提高检测的灵敏度,现多在引物和探针的标记上进行改进.由于放射性标记物的危害性,现多采用非放射性标记,如生物素、荧光素、酶及化学发光剂.Wilson等在巢式PCR的内侧引物上分别掺入生物素和地高辛配基,这样PCR产物两端就分别带有生物素和地高辛配基.,技术步骤,多重耐药性结核病的产生原因。什么是耐多药结核病?抗结核药物分为一线药物(如:异烟肼、利福平、吡嗪酰胺等)和二线药物(如:注射用类、氟喹诺酮类、口服抑菌类等)。,结核杆菌的分子耐药机理 异烟肼(INH) 异烟肼通过抑制结核杆菌分枝菌酸的合成,造成细胞壁破损而杀菌。 INH的耐药性与一个或多个基因的多种突变有关。这些基因包括编码触酶-过氧化物酶的KatG基因,编码enoyl-ACP还原酶的inhA基因和编码烷基-氢过氧化物还原酶的ahpC基因。,利福平(rifampin,RFP) 利福平为一种广谱抗菌药物,它可与DNA依赖的RNA聚合酶的β亚单位结合,从而抑制mRNA的转录。在RFP耐药结核杆菌rpoB基因中央附近69bp的高变区域内,存在35种以上不同的错义突变,其中丝氨酸531→亮氨酸(ser531→Leu)和组氨酸526→酷氨酸(His526→Tyr)的两种突变最常见,约占总突变65%以上。13%rpoB基因突变的RFP高度耐药株仍对利福布丁(rifabutin)敏感,提示可采用利福布丁治疗某些RFP耐药的结核病。,链霉素(srreptomycin,SM) 链霉素是抗结核治疗中常用氨基糖甙类抗生素。SM耐药性与编码核糖体的二部分基因突变有关,它们是编码16S rRNA的rrs基因和编码S12蛋白的rpsL基因。rpsL基因是主要突变位点,其中密码子43最常见,密码子88较罕见。16S rRNA分子的环状结构为次要突变点,即491,513,516,903核苷酸位点上。,乙胺丁醇(ethambutol,EMB) 乙胺丁醇的抗菌活性仅局限于分枝杆菌,提示药物靶位是一 种分枝杆菌特有的结构,初步研究显示emb基因编码多种合成细胞壁阿拉伯聚糖必须的酶类,其中embAB基因编码阿拉伯糖基转移酶,embAB基因的突变或过度表达可导致持续合成阿拉伯聚糖而耐药。,吡嗪酰胺(pyrazinamide,PZA) PZA作用机制和耐药分子机理尚不清楚。一般认为PZA是通过在菌体内被吡嗪酰胺酶转化为吡嗪酸而发挥作用。分析结核杆菌和牛分枝杆菌PZA耐药株,发现该酶活性显著降低,提示酶活性丧失与耐药密切相关。Scorpio等发现编码吡嗪酰胺酶的pcnA基因是造成结核杆菌PZA耐药的原因。,氟喹诺酮类(fluoroquinolones,FQ) MDRTB的暴发流行使FQ成为最主要的二线抗结核药物。FQ耐药机理极其复杂,与耐药发生有关因素包括(1)DNA旋转酶,(2)拓扑异构酶Ⅳ,(3)细胞膜蛋白,它通过介导药物的通透性和外流来调节胞内的药物浓度。多个基因突变逐步累加是获得高度耐药性的基础。FQ作用靶位是DNA旋转酶,由gyrA和gyrB基因编码的2个A亚单位和2个B亚单位组成。结核杆菌对FQ的耐药与gyrA和gyrB基因突变有关。,结核杆菌耐药基因的检测方法 直接测序法 耐药区域PCR扩增,PRC扩增产物纯化或克隆化取DNA片段直接测序,与标准敏感菌株的同一DNA片段比较,分析碱基突变的位置和分布。直接测序法是鉴定突变的黄金标准,但该操作繁琐,费用昂贵限制了它的广泛应用。,聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PRC-SSCP) PCR-SSCP是检测单碱基置换和数碱基缺失或插入的可靠而简便方法,比直接DNA测序容易进行,而广泛用作一种突变筛选方法。,固相杂交法 探针杂交法是检测耐药基因突变的另一种快速简便筛选方法。该方法可快速鉴定结核杆菌RFP耐药株ropB基因的突变,适合于临床标本的直接检测。现已有商品化LiPA试剂盒,该试剂盒检测配药物敏感试验结果的符合率为90.2%。,临床意义,临床意义,临床意义,小结: 感染性疾病诊断策略 HBV HCV HIV 基因组结构 HBV HIV TB 分子诊断方法和临床意义,
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