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核酸提取技术(CDC培训).ppt

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核 酸 提 取 技 术,四川大学华西公共卫生学院 王国庆 huaxiwgq@163.com,前 言,核酸是遗传信息的携带者,是基因表达的物质基础。在生物的生长、发育和繁殖等生命活动中起着十分重要的作用。,因此无论是进行核酸结构与功能的研究,还是进行基因工程、蛋白质工程,首先需要对核酸进行分离和纯化,核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。,DNA和RNA都是极性化合物,溶于水,不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂,它们的钠盐比游离酸易溶于水。在酸性溶液中,DNA、RNA易水解,在中性或弱碱性溶液中较稳定。,真核生物中,DNA主要存在于细胞核的染色体中,RNA则主要存在于细胞质中;原核生物中,DNA主要存在于核质区,RNA则主要存在于细胞质中;而非细胞形式存在的病毒和噬菌体,往往只含DAN或只含RNA。,主要内容,核酸提取的目的意义 核酸提取的一般程序 微生物核酸提取的方法原理 核酸提取质量的鉴定 核酸提取的注意事项,核酸提取的意义,从生物材料中分离制备核酸,研究其结构与功能,对于了解生命活动的规律,揭示生命现象的本质有重大意义。,医学检验需要:是分析标本中包含的分子信息的前提条件,对于精确诊断疾病具有重要意义。,基因工程的需要:基因工程疫苗和药物。,核酸提取的一般程序,核酸的提取一般分为两个阶段:,② 分离纯化:使核酸与裂解体系中的其它成分,如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离。,① 裂解细胞:使样品中的核酸游离在裂解体系中。,细胞的裂解,分离提取核酸,首先要求核酸从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来,并保持原来的天然状态,不丢生物活性。因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。但若材料是体液(如血)或生物体分泌到体外的分泌物,则不必进行组织细胞的破碎,一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。 植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁,一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。 细菌细胞的破碎比较困难,因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子,非常坚韧。,细胞的裂解方法:,细菌有坚硬的细胞壁,裂解细胞有三种方法:,①机械方法:超声波处理法、研磨法、匀浆法;,②化学试剂法:用SDS处理细胞;,③酶解法:加入溶菌酶或蜗牛酶,可使细胞壁破碎。,细胞裂解后,核酸与大量杂质在一起,必须进行分离纯化。,关键:蛋白质的去除,核酸的分离纯化,蛋白质的去除可以选择酶法、去污剂法或有机溶剂法或联合运用上述方法。,微生物核酸提取的方法原理,1. 阴离子表面活性剂法,原理:利用SDS等阴离子表面活性剂与蛋白质带正电荷的侧链结合,从而使核酸与蛋白质分开。然后加入浓醋酸钾溶液,使SDS-蛋白质复合物沉淀,并使多余的SDS转化为溶解度小的钾盐而同时沉淀,微生物核酸提取的方法原理,2. 有机溶剂法,原理:利用酚、氯仿的混合液与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形成乳状液,蛋白质因充分接触酚和氯仿而变性,与核酸分开。离心后可分为两相,一般上层为含核酸的水相,下层为有机相,交界处是变性凝聚的蛋白质层。,原理:利用蛋白酶消化降解蛋白质,达到去除蛋白质的目的。,微生物核酸提取的方法原理,3. 酶法,,核酸提取质量的鉴定,纯度,浓度,完整性,>1.9,RNA污染 <1.6,蛋白、酚污染,DNA,核酸提取质量的鉴定,纯度,浓度,完整性,>2.0,异硫氰酸残留 <1.7,蛋白、酚污染,RNA,核酸提取的注意事项,为了确保核酸的完整性,实验应注意:,① 温度不宜过高; ② 控制一定的pH值范围( pH5~9),过酸或过碱均能破坏核酸链中磷酸二酯键; ③ 保持一定的离子强度,有助于维持核酸的空间构型; ④ 减少物理因素对核酸的降解机械剪切力,如强力高速振荡、搅拌、样品反复冻贮等。,DNA提取的方法,基因组DNA的提取,CTAB法SDS法其它,非基因组DNA的提取——质粒DNA,碱裂解法煮沸法,基因组DNA- CTAB法,原理,CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的,通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。,原理,基因组DNA-SDS法,SDS在高温(55~65℃)条件下能裂解细胞,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸; 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度(冰浴),使蛋白质及多糖杂质沉淀,离心后除去沉淀; 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。,SDS法流程图,基因组DNA-SDS法,基
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