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组氨酸缺陷型菌种筛选.ppt

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组氨酸缺陷型菌种筛选.ppt
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His-菌株的筛选,,1.实验目的,观察亚硝酸对大肠杆菌的诱变效应 学习并掌握化学诱变育种的方法,2.实验原理,野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力,只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。 经过诱变后的菌株,缺陷型很少必须淘汰野生型细胞,提高缺陷型细胞所占比例,达到浓缩缺陷型的目的。青霉素只杀死生长的细胞,对不生长的细胞不影响,所以在基本培养基中加入青霉素可以达到浓缩缺陷型细菌的目的。 检出缺陷型的方法有很多,这里主要以影印培养法为例进行说明。,3.实验材料、培养基与器材,材料:野生型大肠杆菌 培养基:基本培养基(minimal medium,MM):仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基;完全培养基(complete medium,CM):凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基;肉汤培养液 ;补充培养基(supplemental medium,SM):在基本培养基中加入组氨酸营养因子。 器材:灭菌培养皿、灭菌离心管、移液枪、酒精灯、接种环。,四.实验步骤,1.菌液制备 把培养好的野生型大肠杆菌制成菌液,吸取5ml的菌液与离心管中,离xin(3500r/min)10min,倒去上清液,打匀沉淀。 2.诱变处理 ①吸取亚硝酸溶液5ml于离心管中,37℃处理40s,再加入10mlpH8.6的0.07molNa2HPO4溶液以终止亚硝酸的反应。 ②将上述菌液吸取3ml接种于盛有3ml肉汤培养液的试管中,置37℃培养过夜。,3.营养缺陷型的浓缩,①吸4.5ml处理过的菌液于以灭菌过得离心管,离心(3500r/min)10min。 ②倒去上清液,打匀沉淀,加入生理盐水4.5ml,离心洗涤三次,加入生理盐水到原体积。 ③吸取经离心洗涤的菌液0.1ml于5ml无N基本培养液,37℃培养12h。 ④然后按1:1加入2N基本培养液5ml,称取青霉素钠盐,使青霉素在菌液中的浓度约为1000单位/ml,再放入37℃恒温箱中培养18h。,4.营养缺陷型的检出,(1)将较小平皿直径小1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的丝绒,用金属夹夹住,灭菌。 (2)完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻一压,使之成为印模,标记方位。 (3)将培养基平皿和完全培养基平皿在标记的同一方位上先后轻轻一压,此菌印模即复印于上。 (4)将CM和MM在恒温箱中培养。 (5)二平皿相同方位进行比较,即可发现在MM平皿上长出菌落少于CM平板上的。MM上未长而相应于CM上长出的那几个菌落就可能是缺陷型。 此方法要求平皿上菌落不能太多,菌落之间应有一定间隔。,5.组氨酸营养缺陷型的鉴定,①将可能是缺陷型的菌落接种于盛有5ml肉汤培养液的离心管中,37℃培养14-16h。 ②然后离心(3500r/min)10min,倒去上清液,打匀沉淀,然后离心洗涤三次,最后加入1ml生理盐水。 ③将离心洗涤的菌液用接种环分别划线于只加了组氨酸的基本培养基、基本培养基、完全培养基中,然后置于37℃恒温箱中培养24-48h,观察结果,找出组氨酸缺陷性菌。,,Thank You!,
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