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CRISPR操作系统(原理).doc

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一图看破 CRISPR 操作系统!近日,Cell 发表了一篇名为“SnapShot: CRISPR-RNA-Guided Adaptive Immune Systems”的精华文章,用一张图,就全解析了 CRISPR 系统的“中心法则”。今天就让麦子带大家分解此图,真正掌握时下这个可以对人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物等细胞内的基因进行精确编辑的热门技术之精髓:细菌和古细菌已经根据 CRISPR(规律成簇的间隔短回文重复,Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)位点和多样化 CRISPR 相关(CRISPR-associated,Cas)基因,进化出了复杂的 CRISPR 适应性免疫系统。CRISPR 系统可以分为三种类型(I-III)及至少 11 种不同的亚型(I-A~I-F,II-A~II-C,III-A~III-B)。但是所有的 CRISPR-Cas 免疫系统都是通过主要的三个阶段来行使功能: 外来 DNA 的采集 CRISPR RNA 的生物合成 靶向干扰第一阶段:外来 DNA 的采集(Foreign DNA Acquisition)宿主通过 Cas 蛋白来识别外源核苷酸,入侵细菌的短片段 DNA 称为protospacers,它们作为间隔区序列插入到了宿主的 CRISPR 位点。在 I 和 II型系统中,protospacers 选择自入侵 DNA 旁出现 PAM 的区域(PAM :protospacer adjacent motif,对于 CRISPR 结合至关重要)。一般protospacers 通过包含 Cas1、Cas2 和游离 3'-羟基等元件的机制连接在CRISPR 位点的前导区(Leader) 。Protospacer 的整合也伴随着末端重新序列复制,这可能涉及宿主聚合酶和 DNA 修复机制。第二阶段:CRISPR RNA 的生物合成(crRNA Biogenesis)CRISPRRNA 的生物合成从转录开始,接下来是初级转录产物 pre-crRNA 加工生成一类短的 CRISPR 衍生 RNAs(crRNAs),每一个都包含与之前遇到的外源 DNA(Spacer 序列)对应的互补序列。crRNA 导向序列的两侧是相邻重复序列区域。在 I 型和 III 型系统中,初始 CRISPR 转录产物会被 CRISPR 特异性核酸内切酶(Cas6 或 Cas5d)在重复序列位点内切割。在许多 I 型系统中,重复序列是回文结构的,Cas6 可以稳定连接在 crRNA 3'端茎环上。而在 III 型系统中,Cas6 短暂与 CRISPRRNA 连接,crRNA 的 3'端会被未知的核酸酶进一步处理。CRISPRRNA 的加工在 II 型系统中依赖于包含一个与重复序列互补序列的反式作用 crRNA (tracrRNA)。这些双链的区域在 Cas9 存在时可以被 RNaseIII 加工,靶向干扰需要 tracrRNA 和 crRNA 的同时存在。II 型系统中的这两个RNAs 可以融合成一个 sgRNA,目前,II 型系统是我们研究的“火力”较为集中的系统,而 Cas9 已经变成了在多种细胞类型和组织中靶向基因编辑的强大工具。第三阶段:靶向干扰(Target Interference)成熟的 crRNAs 指导 Cas 蛋白到互补靶标,靶序列由特异性的 Cas 核酸酶降解,但不同的 CRISPR 系统降解机制存在差异:I 型和 II 型系统都可以靶向包含PAM 和 protospacer 互补序列的 dsDNA 底物。在 II 型系统中,靶标的降解是通过单一的蛋白 Cas9 和两个 RNAs 来实现的,而在 I 型系统中,则依赖于包含多个亚型的复合物,可以结合 dsDNA 并招募 Cas3,Cas3 是一个反式作用的核酸酶,经常融合到依赖于 ATP 的解旋酶上。类似于 I 型系统,III 型系统也同样依赖于探测目标的多亚基复合物,这些复合物展示出了内源性核酸酶活性,依赖于转录方式降解互补的 RNA、靶向 DNA,不过 III 型系统不依赖于 PAM进行靶标位点的识别,而是通过碱基互补配对,导向序列延伸至 crRNA 信号5'handle 的核苷酸进行识别(CRISPR 位点包含与导向序列,5'handle 互补的序列),并阻止靶向裂解。关闭颈环在 I 型系统中,复合物靶向结合会导致 Cas3 介导的靶向降解(直接干扰)或最初采集,这其中涉及 crRNA 导向募集 Cas3、Cas1 和 Cas2 到外源 DNA 处,引起新一轮的快速采集。II 型系统中虽然未观察到最初采集,但 Cas9 是protospacer 正确筛选的必
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