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GM-CSF在肺纤维化大鼠肺组织中的表达.doc

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GM-CSF在肺纤维化大鼠肺组织中的表达.doc
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GM-CSF 在特发性肺纤维化大鼠肺 组织中的表达及其可能的作用机制蔡欣 梁标[摘要] 目的:通过阐明肺纤维化过程中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子( GM-CSF)水平在肺纤维化大鼠肺组织的表达,探讨 GM-CSF 在特发性肺纤维化发病机制中的作用。方法:40 只健康成年雌性大鼠随机分为模型组 20 只和正常对照组 20 只,模型组气管内一次性注射博来霉素5mg·kg -1 造肺纤维化模型,对照组气管内注射生理盐水,各组均于第 1,3,7,14 天分别处死 5 只,对大鼠肺组织予 HE 染色,光镜观察病理改变;碱水解法测定大鼠肺匀浆中的羟脯氨酸含量;ELISA 法测定 GM-CSF 在肺组织匀浆中的水平。结果:模型组大鼠肺泡炎、肺纤维化的程度均明显高于对照组;模型组肺组织中的羟脯氨酸含量明显高于对照组;正常大鼠肺组织中 GM-CSF 含量有一定水平,模型组的大鼠肺匀浆中的 GM-CSF 水平在第 3 天迅速增高并达到高峰,此后逐渐下降,但第7 天和第 14 天时仍明显高于对照组(p0.01)。结论:GM-CSF 在肺纤维化模型大鼠肺组织中明显增高,可能在肺纤维化发病机制中起重要作用。[关键词 ]肺纤维化;博来霉素;GM-CSF前言特发性肺纤维化(IPF)是一种严重影响人们生活质量和生命健康的疾病,其发病机理复杂,与诸多因素有关,发病过程中有多种炎症细胞参与 (1)。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF )是一种来源广泛细胞因子,可促进多种包括单核巨噬细胞,中性粒细胞在内的多种炎症细胞游走 (2)。本研究通过建立大鼠肺纤维化模型,将大鼠分为用 ELISA 法测定 GM-CSF 在肺纤维化大鼠肺组织中的表达,。方法一、 实验动物40 只 3 月龄近交系健康成年雌性 SD 大鼠(SPF 级)(本校实验动物中心提供),体重 200±20g。动物实验室温度 22±2 度,湿度 54%.二、药剂与试剂1、羟脯氨酸(Hyp)测试盒及羟脯氨酸测试前处理碱水解试剂 购自南京建成生物工程研究所。2、博来霉素 由日本化药株式会社生产3、GM-CSF ELISA 试剂盒 由美国 Biosource 生物工程公司生产。4、非变性裂解缓冲液 购自北京五洲元业生物工程有限公司。三、方法:(1)将 40 只大鼠随机分为两组,分别为模型组和正常对照组,①模型组予 2%戊巴比妥(30mg/kg)腹腔内注射后,逐层暴露气管,气管内一次性注入博来霉素 5mg·kg-1,注射后将大鼠直立旋转,使药液在肺内分布均匀,缝合伤口。②对照组气管内给予与模型组博来霉素等量的生理盐水。每组分别在1,3,7,14 天各处死 5 只。动物处死后进行以下操作:肺组织病理标本的制备:将心肺完整取出,结扎左主支气管,分离左肺,取左下肺用 10%福尔马林固定,石蜡包埋,用于病理观察。取左上肺于液氮保存。制成肺细胞匀浆用于 GM-CSF ELISA 测定,取右肺于液氮保存,用于羟脯氨酸测定 (3)。(2)病理学检查:根据 Szapiel 的方法确定肺泡沿河肺纤维化的程度。用HE染色的病理切片将肺泡炎分为4期:(1)无肺泡炎;(2)轻度肺泡炎(Ⅰ级);(3)中度肺泡炎(Ⅱ级) ;(4)重度肺泡炎(Ⅲ 级)- (4)。(3)肺组织匀浆 GM-CSF 测定:取组织块(200mg) 在冰冷的生理盐水中漂洗,剪碎,将剪碎的组织倒入玻璃组织匀浆器中,加入非变性裂解缓冲液 1ml,一起倒入匀浆管中匀浆,使组织裂解析出蛋白,将捣杆上下转动研磨,充分研碎,使组织匀浆化。将制备好的 10%匀浆用低温离心机 12000r/min 左右离心 10 分钟,取上清液,弃下面沉淀。上清液用 ELISA 法测定 GM-CSF,严格按说明书操作 (5)。(4)肺组织羟脯氨酸测定:取右肺,沉重后剪碎,每克肺组织加无菌生理盐水4ml ,以 3000r/min 离心 10min,过滤得上清液,用碱水解法测定羟脯氨酸含量。严格按说明书操作。(5)统计方法:实验数据用用数据用 X±S 表示表示,用 SPSS 统计软件进行 t 检验。P0.05,差异有显著意义, P0.01 差异有非常显著意义。 结果1,一般情况 治疗前各组体重差异无显著性,模型组组第 7、14 天组体重均较对照组明显下降,各相应天数模型组组大鼠进食,活动等一般情况均较对照组差。2,肺组织病理变化 对照组:第 1-3 天肺间质中有少量巨噬细胞、中性粒细胞。淋巴细胞等炎症细胞浸润,肺泡隔略增宽,此后无明显异常。模型组:第 1 天可见肺间质和肺泡腔内有部分中性粒细胞、肺泡巨噬细胞渗出,肺泡壁略增宽;第 3 天可见肺泡壁水肿,肺内中性粒细胞、淋巴细胞增多,尚有部分嗜酸性细胞;第 7 天可见肺间隔增厚,局部肺泡塌陷,有大量炎症细胞渗出,嗜酸性细胞较第 3 天多,成纤维细胞、毛
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