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临床分子生物学检验.doc

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1绪论1.20 世纪 50 年代, Waston 和 Crick 提出了 DNA 双螺旋结构,标志着现代分子生物学的兴起。2.从广义上来讲,应用到临床的分子标志物包括基因组 DNA、各种 RNA、蛋白质和各种代谢物,目前,临床分子生物学检验的靶标主要以核酸(DNA 或 RNA)为主。第一章:核酸与分子标志物1.分子标志物:可以反映机体生理、病理状态的核酸、蛋白质、代谢产物等生物分子,是生物标志物的一种类型。核酸分子标志物是分子生物学检验的主要内容,包括基因突变、DNA 多态性、基因组 DNA片段、RNA 和循环核酸等多种形式。2.DNA 的组成 :是一种高分子化合物,其基本单位是脱氧核苷酸,每个核苷酸由磷酸、脱氧核糖和含氮碱基 3 部分组成。3.DNA 与 RNA 的区别:2 位脱氢。4.DNA 的结构:①DNA 一级结构:各种核苷酸单体沿多核苷酸链排列的顺序,表明该 DNA分子的化学构成。②DNA 二级结构:双螺旋结构,DNA 双螺旋的直径为 2nm,一圈螺旋含10 个碱基对,每一圈螺距为 3.4nm,每个碱基的旋转角度为 36 度。维持 DNA 结构稳定的力量主要是碱基对之间的堆积力,碱基对之间的氢键也起着重要的作用。③DNA 三级结构:DNA 双螺旋进一步盘曲形成的更加复杂的结构。5.核小体的形成(真核生物染色体包装过程):在核小体中,DNA 盘绕组蛋白八聚体核心,使 DNA 缩短为原来的 1/7;6 个核小体形成螺丝管,缩短为 1/6;核小体彼此相连成串珠状染色质细丝,螺旋化形成染色质纤维,进一步折叠成染色单体。6.DNA 双螺旋结构的变异:右手螺旋 A-DNA、C-DNA、D-DNA、E-DNA、H-DNA、L-DNA、P-DNA,左手螺旋 Z-DNA 7.RNA 主要分为三类:tRNA、rRNA、mRNA 还有一些小型 RNA:反义 RNA、微小RNA(microRNA,miRNA 是一类内源性的具有调控功能的非编码 RNA。 )8.真核 mRNA 与原核 mRNA 的区别(简答题)原核 mRNA 结构简单,为多顺反子,编码序列之间有间隔序列,原核生物 mRNA 中没有修饰碱基。真核生物 mRNA 为单顺反子结构,成熟的 mRNA 中 5’端有帽子结构,3 ’端有 polyA 尾巴。9.原核生物主要的 rRNA(占细胞总 RNA80%)有三种:5S、16S 、23S;真核生物有四种5S、5.8S、18S 和 28S rRNA10.基因:能编码有功能的蛋白质多肽链或合成 RNA 所必需的全部核酸序列,是核酸分子的功能单位。11.顺式调节:一个基因的调控区和结构基因位于同一 DNA 分子的相邻部位,其作用是参与基因表达的调控。12.启动子:一段位于结构基因 5’端的上游的 DNA 序列,能活化 RNA 聚合酶,使之与模板DNA 准确地结合并具有转录起始的特异性。操纵序列(操纵元件)可被具有抑制转录作用的阻遏蛋白识别并结合12.真核生物基因结构包括外显子和内含子,称为断裂基因13.增强子:可位于基因的上游或下游,也可位于内含子中,它不能启动一个基因的转录,但有增强转录的作用214:表观遗传:在 DNA 序列不发生改变的情况下,基因功能出现可逆的、可遗传的变化。包括组蛋白修饰(包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、糖基化) 、DNA 甲基化、RNA干扰等。15.DNA 甲基化:生物体在 DNA 甲基转移酶的催化下,将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA 甲基化一般发生在 CG 双核苷酸的 C 上面。16.基因突变类型:点突变、插入缺失、动态突变17.错义突变:点突变改变了三联体密码子,导致基因产物中某个氨基酸被另一个氨基酸所取代。18.无义突变(链终止突变):DNA 序列的改变使得编码某一氨基酸的密码子突变终止密码,则导致翻译过程提前终止。19.基因组:一个细胞或一种生物体的整套遗传物质,包括基因和非编码 DNA20.原核生物基因组特征:1 基因组较小2 没有典型的细胞核结构3 操纵子结构是原核生物基因组的功能单位4 原核生物的结构基因中无内含子成分,不需要经过剪接加工过程5 具有编码同工酶的基因6 含有可移动 DNA 序列21.质粒:指细菌细胞染色体以外,能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状分子。22.转座因子(转座元件):是一类在细菌染色体、质粒或噬菌体之间自行移动并具有转位特性的独立的 DNA 序列。包括插入序列、转座子、Mu 噬菌体23.病毒基因组类型:24.人类基因组包括:细胞核内的核基因组和细胞质内的线粒体基因组。25.人类基因组的最大特征:存在大量的非编码序列和重复序列26.多基因家族:由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因。27.假基因:在多基因家族中,某些成员并不产生有功能的基因产物,这些基因称为假基因。28.多态性:不同的个体之间,在基因组 DNA 序列上会存在差异,平均而言,一对同源染色体每 1000 个碱基就会出现一个碱基的差异( 基因组中蛋白质编码区大概是每 2500 个碱基出现一个差异)。当某种变异相对常见,在群体中的频率高于 1%时,则成为多态性。29.人类基因组多态性形式:1 限制性片段长度多态性2 小卫星和微卫星多态性3 单核苷酸多态性4 拷贝数多态性30. 单核苷酸多态性:在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的 DNA 序列多态性第 2 章:核酸杂交技术1.核酸分子杂交:单链的核酸分子在合适的条件下,与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程。2.核酸分子杂交的基本原理:在一定条件下,双螺旋之间氢键断裂,DNA 分子成为单链;将一种核酸单链标记成为探针,再与另一种核酸单链进行碱基互补配对,变性 DNA 只要消3除变性条件,有碱基互补区域的单链又可以重新结合成双链,形成异源核酸分子的双链结构。3.复性:变性 DNA 只要消除变性条件,有碱基互补区域的单链又可以重新结合成双链,这一过程称作复性。4.变性:在一定条件下,双螺旋之间氢键断裂,双螺旋解开,DNA 分子成为单链,形成无规则线团,这一过程称作变性5.Tm 融解温度大小取决于 DNA 分子的长度和核酸分子的 C-G 含量,C-G 碱基含量越高,Tm 值越高。6.探针:指所有能与她特定的靶分子发生特异性的相互作用。7.核酸探针:特指能与靶核酸序列发生碱基互补杂交,并能由其标记被特异性检测的核酸分子。8.探针的标记方法:①放射性标记: 32P 标记的放射性探针敏感而可靠,可以检测到含量极微的核酸分子而且不会妨碍核酸分子间的杂交。②非放射性标记:非同位素探针多由生物素、地高辛或荧光素标记。无环境污染,可较长时间贮存。9.核酸分子杂交类型:液相杂交、固相杂交、原位杂交10.Southern 印记杂交 :两个主要过程:一是将待测定核酸分子转移并结合到一定的固相支持物上;二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火,即分子杂交过程。11.Southern 印记杂交原理:将凝胶上的 DNA 变性并在原位将单链 DNA 片断转移至固相支持物上,经紫外线照射固定,再与相对应结构的标记探针进行杂交,用放射自显影或酶反应显色,从而检测特定 DNA 分子的含量。12. Southern 印记杂交与 Northern 印记杂交的区别:Southern 印记杂交是检测 DNA 的,Northern 印记杂交是检测特异 mRNA 的。第 3 章:核酸扩增技术1.聚合酶链反应(PCR)技术是 1983 年 K.Mullis 发明的。基本原理和过程与细胞内 DNA 的复制相似,PCR 重复进行 DNA 复制的过程,使 DNA 得以扩增。2.PCR 的基本原理:与细胞内 DNA 复制相似。过程:变性、退火、延伸。3.PCR 扩增体系:模板、引物、 dNTP、TaqDNA 聚合酶和缓冲液等。4.实时 PCR 技术:主要包括 DNA 交联荧光染料技术和荧光共振能量转移技术。5.DNA 交联荧光染料技术:SYBR GreenⅠ染料能选择性地渗入至双链 DNA 分子中,并产生强烈荧光,结合的荧光信号和 DNA 含量成正比。缺点是特异性不够,使反应体系中荧光本底较高。6.水解探针技术标记原理:反应体系中除了两条引物还要一条荧光素标记的探针,探针的5’端标记荧光报告基团 R,3’ 端标记荧光淬灭集团 Q。当探针完整时 R 基因和 Q 基因分别位于探针的两侧,Q 基团抑制 R 基团使其不能发射荧光。7.Ct 值:处于扩增曲线和荧光本底基线的交叉点处相应的反应循环数。Ct 值的大小与样品中模板 DNA 的起始拷贝数成反比,起始模板量越高, Ct 值越小,反之越大。8.当温度升至其熔点温度(Tm)时荧光量急剧下降而形成熔点曲线,其波峰所在温度即代表被检 DNA 分子的 Tm 值。 (SYBR GreenⅠ标记时用熔点曲线校正)第 4 章:核酸序列分析41.双脱氧链终止法是 Sanger 发明的,原理:1 进行测序反应 Sanger 引入了双脱氧核苷三磷酸( ddNTP)作为链终止物,ddNTP比 dNTP 在 3’端缺少一个羟基,不能同后续的 dNTP 形成 3’,5’-磷酸二酯键,因此正在增长的 DNA 链不再延伸。2 凝胶电泳和序列读取2.DNA 自动分析技术的测序反应西主要包括:DNA 模板、测序引物、 DNA 聚合酶和荧光标记等。3.商品化的测序平台主要有:罗氏/454 公司的 GS FLX 测序平台、Illumina/Solexa 公司的Genome Analyzer 测序平台和 ABI 公司的 SOLiD 测序平台。4.第二代测序技术基本原理:先进行文库制备,即将片段化的基因组 DNA 两侧连上通用接头;随后运用 PCR 扩增技术来生产几百万个空间固定的 DNA 簇,这种 DNA 簇由单个文库片段的多个拷贝组成,称 PCR 克隆阵列或称聚合酶克隆,最后进行测序,即测定每个克隆的核甘酸序列5.DNA 簇 由单个文库片段的多个拷贝组成,称 PCR 克隆阵列或称聚合酶克隆。6.第三代测序技术(单分子测序技术):该技术利用单分子技术和 DNA 聚合酶,在聚合反应的同时就可以读取测序产物。第 5 章:生物芯片技术1.生物芯片:将大量生物大分子有序地固化于支持物表面,组成密集二维分子排列,然后与标记的待测生物样品中的靶分子杂交,通过特定仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析,从而判断样品中的靶分子数量。主要特点是高通量、微型化和自动化。2.生物芯片根据固定的探针种类不同分为:DNA 芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片等;根据芯片的用途不同分为:表达分析芯片、测序芯片和芯片实验室等。3.DNA 芯片原理:核酸杂交原理。4.常见的芯片制备方法:原位合成(在片合成) 、直接点样(离片合成)5.蛋白质芯片:将蛋白质或多肽有序地固定在固相载体表面形成微阵列,用标记了荧光的蛋白质与之作用,洗去未结合的成分,经荧光扫描测定芯片上各点的荧光强度,来分析蛋白质之间或蛋白质与其他分子之间的相互作用关系。第 6 章:蛋白质组学技术1.蛋白质组:一种基因组所表达的全部蛋白质,即包括一个细胞或一个组织或一个机体的基因所表达的全部蛋白质。2.Western 印记 又称免疫印迹,是一种蛋白质测定技术。3.Western 印记原理: 蛋白质之间作用,依据 Southern 印记杂交。过程:4.双向凝胶电泳的原理:第一向电泳是依据蛋白质的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质在 pH 梯度介质中外加电场作用形成分离的蛋白质区带。5.目前在蛋白质组研究中,ESI 质谱仪和 MALDL-TOF 质谱仪最为常用。第 8 章:病毒感染的分子生物学检验1.乙型肝炎病毒基因组结构:HBV DNA 是带有部分单链区的环状双链 DNA 分子,是目前已知感染人类最小的 DNA 病毒。基因组长为 3.2kb。HBV 的两条链长度不等,长链(负链)携带有病毒全部的编码信息;短链(正链)在不同分子中长度不等。2.HBV 基因组负链 DNA 主要有四个开放读码框架: S 基因区(编码外膜蛋白) 、C 基因区5(编码核心蛋白) 、P 基因区(编码多聚酶蛋白) 、X 基因区(编码 X 蛋白)HBsAg 是机体受 HBV 感染的主要标志之一。3.HIV 为逆转录 RNA 病毒。4.人类免疫缺陷病毒基因组结构:有两条相同的正义 RNA5.在 HIV-1 基因组中 3 个结构基因,编码结构蛋白:gag 基因(编码结构蛋白) 、pol 基因(编码逆转录蛋白) 、env 基因(编码包膜前体蛋白)6.6 个调控基因:tat、rev、nef、vif、vpr、vpu/vpx 等。7.流感病毒的遗传物质:单股负链 RNA8.人流感病毒分为甲(A) 、乙( B) 、丙(C)三型,流感病毒的遗传物质是单股负链 RNA第 11 章:单基因遗传病的分子生物学检验1.人类的单基因遗传病的主要遗传方式分为三种:常染色体遗传、X 连锁遗传、Y 连锁遗传。单基因遗传病分子生物学检验的策略包括直接和间接诊断策略直接诊断策略:直接揭示导致遗传病发生的各种遗传缺陷,即用分子生物学技术直接检出致病基因的突变或由于结构变化与转录异常导致的基因的表达量的改变等遗传缺陷。2.镰状细胞贫血发生的分子机制:镰状细胞贫血患者由于 β 珠蛋白基因中第 6 位密码子存在单个碱基的突变,由原来的 GAG 变成 GTG,使谷氨酸变成缬氨酸,导致氧结合能力过低,红细胞发生镰变。第 12 章:肿瘤分子生物学检验1.肿瘤相关的基因:原癌基因、肿瘤抑癌基因、细胞周期调节基因、细胞凋亡基因、维持细胞基因组稳定基因、肿瘤转移相关基因、肿瘤血管生成相关基因2.原癌基因:人类固有的一类基因,能诱导细胞正常转化并使之获得新生物特征的基因总称。原癌基因激活机制包括:插入激活、基因重排(染色体异位) 、基因点突变(移码突变)、基因扩增、基因转录改变3.抑癌基因:可编码对肿瘤形成起阻抑作用蛋白质的基因,正常情况下负责控制细胞的生长和增殖。6一、 血液基因组提取1. 苯酚/氯仿作用:对蛋白质有极强的变性作用,而对 DNA 却没有影响,经苯酚/氯仿抽提后,苯酚/氯仿层与水相完全分层,蛋白质变性而被离心沉淀降到苯酚/氯仿相和水相的界面,DNA 则留在水相。标本中的脂类杂质溶解于苯酚/ 氯仿,从而与水相分离得以去除。2. 异丙醇:沉淀 RNA3. 加入苯酚/氯仿后离心,分为三层分别是:水、变性的蛋白质、有机溶剂(氯仿) 。4. 电泳结果分析:二、 动物组织总 RNA 的提取及鉴定1. 电泳A.结果分析:B.电泳方向:负极泳动到正极(RNA 带负电) 。C.电泳中分子量大跑的慢D.上样缓冲液 Loading Buffer 成分:蔗糖(增加样品质量) 、溴酚蓝(指示电泳过程)2. 溴化乙锭 EB 作用:结合核酸,紫外光下变红 3. 注意事项:a.为防止 RNA 酶污染,要对试剂 RNA 酶处理,戴手套b.若 RNA 降解,重新提取4. OD260nm=1 时 DNA=50ng/µl,RNA=40ng/µl;OD 260nm/OD280nm=1.8 纯 DNA,OD 260nm/OD280nm=2.0纯 RNA;质量控制 1.8-2.0三、 RT-PCR71. 逆转录 RT:变性 70℃ 5min,使 RNA 二级结构变性;退火 冰上 2min;延伸 42℃ 60min2. PCR:反应体系成分:原料、酶、模板、引物;条件:DNA 变性 94℃,延伸 72℃
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