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发酵工程4.ppt

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第四章 培养基及其制备,本章教学内容,第一节 原料 第二节 原料的预处理 第三节 淀粉的水解糖的制备 第四节 糖蜜原料的处理 第五节 前体物质、促进剂,第一节 原料,一、原料的定义及选择原则 1,原料的定义: 从工艺角度来看,凡是能被生物细胞利用并转化成所需的代谢产物或菌体的物料,都可作为发酵工业生产的原料。,2,原料选择的原则 原料价格低廉; 因地制宜,就地取材; 原料资源要丰富,容易收集; 原料要容易贮藏; 对人体无害,影响发酵过程的杂质含量因应当极少,或者几乎不含; 适合微生物的需要和吸收利用。 对生产中除发酵以外的其他方面,如通气、搅拌、精制、废弃物的处理等所带来的困难最少。,在确定原料选择原则时需注意的问题,所选用的培养基与所使用的发酵器的结构有关。 例如ICI公司因指定用甲醇和氨生产单细胞蛋白质而另行设计新的发酵罐。 同样的理由,在一个巳设定的发酵罐中,发酵必然会受到培养基组份改变的影响。 从实验室规模放大到实验工厂规模,以至于放大到工业生产规模,都要考虑培养基的组份的变化。 培养基的组成,除了考虑到菌体生长和产物的形成的需要外,还要考虑到培养基的pH变化、泡沫的形成、氧化还原电位和微生物的形态等,而且还有前体和代谢抑制剂的需要。,二、常用主要原料及其化学组成,1,常用原料种类 薯类:甘薯、马铃薯、木薯、山药等。 粮谷类:高粱、玉米、大米、谷子、大麦、小麦、燕麦、黍和稷等。 野生植物:橡子仁、葛根、土茯苓、蕨根、石蒜、金刚头、香符子等。 农产品加工副产物:米粞、米糠饼、麸皮、高粱糠、淀粉渣等。 其它原料:石油化工产品、无机盐类等。,2,常用原料的化学组成 碳水化学物:主要是单糖和双糖,发酵微生物的碳源和能源。一些多糖则需转化为单糖或双糖后才被利用。 蛋白质:蛋白质经蛋白酶分解后产生的多肽或氨基酸,是微生物生长繁殖的氮源。 脂肪:针对不同的发酵产品其作用有较大差别 灰分:主要是P、Mg、K、S、Ca等元素,是微生物生长和代谢所必需的。,三、工业发酵培养基的设计,1,为何要进行培养基的设计? 完善的培养基设计是实验室的试验、实验工厂和生产规模的放大中的一个重要步骤。 在发酵过程中,我们的目的产品是菌体或代谢产物。而发酵培养基是否适合于菌体的生长或积累代谢产物,对最终产品的得率具有非常大的影响。,2,培养基设计的基本原则,培养基的组成必需满足细胞的生长和代谢产物所需的元素,并能提供生物合成和细胞维持活力所需要的能量。,3,如何进行培养基的设计 (1)作出细胞生长和产物形成的化学计算的平衡碳源和能源+氮源+其他需要→细胞+产物+CO2+H2O+热量 通过计算可以获得生产一定数量的细胞时所需的营养物的最低数量。在了解一定数量的生物体所能产生的产物数量后;就有可能计算出形成产物时所需的底物数量。 这些培养基的组份的数量仅仅是供给细胞形成产物,而不包括生成细胞所需的营养。所有上述各项数量,是不易获得其精确的数字。,,(2)组成微生物的元素包括C、H、O、N、S、P、Mg和K(见下表),这些元素都要在方程式中予以平衡 在培养基中有些元素的含量往往超过需要量,如P和K。而其它元素含量则接近最低值(如Zn,Cu等)。在许多培养基中增加磷酸盐浓度,其用意是增加培养基的缓冲容量,这一点,在设计培养基时要引起注意。,细菌、酵母和真菌的元素组成(按干重%计),,,(3)有些微生物无力的合成特定营养物,如氨基酸、维生素或核苷酸。一旦测出其中一种是生长因子,就要在培养基中加入适量的纯净的化合物或含有该物质的混合物。,,(4)碳源具有生物合成的底物和能源的双重作用,在需氧条件下,对碳源的需要量可以从菌体对底物的产率系数(Yx/s)推算而得。 该系数的定义是:细胞干物质的产量/碳源底物的被利用量,下表中列出了一些Yx/s值。如以葡萄糖为底物时,其Y值为0.5g即表示每1g葡萄糖能生成0.5g细胞干物质。为要获得30gdm-3浓度的细胞,需要葡萄糖30/0.5=60gdm-3。,,在发酵过程中,适当地补充碳源是必要的。将碳源转化成产物的观察值与理论上最大值之间进行比较,才能进行深入的研究。但由于对生物合成的知识的限制而难以作出精密的分析。,方程式中的a2、b2、c2、d2、e2、nz、p2和q2都是化学计算中的系数,PAA代表苯乙酸。解方程式.得:,,,按上述方程式计算每1g葡萄糖能产生1.1g苄青霉素的理论值。在青霉素分批发酵的一个简单模型中,用于合成细胞、维持生命活力和转化成青霉素的葡萄糖,分别占总糖耗量的28、61和11%。在分批补料发酵时,则26%的葡萄糖用于生长、70%用于维持生命、6%用于合成青霉素。1g葡萄糖的最大青霉素转化产量为0.0538g,这个理论值数倍于实验值。,Cooney(1979)以青霉素生物合成的途径为基础,通过物质和能量平衡,计算出青霉素生物合成的理论值。总的化学计算式为,,4,发酵培养基的组成成分 水 碳源 氮源 无机盐 维生素 缓冲剂 前体和代谢调节剂 消沫剂,影响选择碳源的因素,原料成本占生产总成本 的比例; 在某些发酵过程中,必须除去碳源中的杂质; 对碳源的选择,往往还受到政府政策的影响; 当地的法律条例指定了许多饮料业所使用的底物; 培养基的配制方法,特别是灭菌方法。,缓冲剂 控制pH时对获得最佳生产能力是十分重要的。在培养基中加入一种化合物作为缓冲剂或同时可作为营养源。许多种培养基多加入碳酸钙作为缓冲剂,以达到pH7.0左右。如果pH下降,则碳酸钙分解,如果是pH上升,可以自然地校正微生物的产酸量。在许多培养基中,也用磷酸盐作为重要的缓冲剂。 碳源和氮源的平衡,也是控制pH的一种方式。在玉米浆中的蛋白质、肽、氨基酸等也具有缓冲容量。滴加氨,氢氧化钠和硫酸,可以严格地控制pH值。,第二节 原料的预处理,一、预处理的必要性 1,发酵工厂在进行生产前,必须先将原料中混杂的小铁钉、杂草、泥快和石头等杂质除去,保证后续工序生产的正常和顺利进行。 2,为保证后续工序生产的正常和顺利进行,还需对原料进行适当加工。 3,为保证生产环境的清洁,必须采用适当的输送方式将原料从仓库运送至配料罐或反应器。,第三节 淀粉水解糖的制备,一、淀粉的水解的理论基础 1,淀粉的颗粒的外观 淀粉颗粒呈白色,不溶于冷水和有机溶剂,其内部呈复杂的结晶组织。随原料品种和种类的不同,淀粉颗粒具有不同的形状和大小。形状不规则,大致上可分为圆形、椭圆形和多角形。 一般说来,水份含量高,蛋白少的植物,颗粒较大,形状较整齐,大多为圆形或卵形,如马铃薯、甘薯的淀粉。 颗粒较大的薯类淀粉较易糊化,颗粒较小的谷物淀粉相对较难糊化。,淀粉颗粒的形状,2,淀粉的分子结构 淀粉可分为直链和支链淀粉两类。 直链淀粉通过α-1,4键连接 。 支链淀粉的直链部分通过α-1,4键连接,分支点则有α-1,6键连接,支链平均有25个葡萄糖基团,因而还原性末端数量较少。 一般植物中直链淀粉含量为20~25%,支链淀粉占75~80%。 直链淀粉在70~80℃的水中可溶,溶液的粘度较小,遇I2呈纯蓝色;支链淀粉在高温水中可溶,溶液的粘度大,遇I2呈兰紫色。,3,淀粉在水-热处理过程的中变化 (1)水-热处理的概念 将淀粉质原料与水一起,在高温高压或低温低压的条件下进行处理的过程。(2)水-热处理的目的 淀粉原料经过水热处理,使淀粉从细胞中游离出来,并转化为溶解状态,以便淀粉酶系统进行糖化作用,这就是原料水-热处理的主要目的。,(3)淀粉的膨胀和溶解 膨胀:淀粉是一种亲水胶体,遇水加热后,水分子渗入淀粉颗粒的内部,使淀粉分子的体积和重量增加,这种现象称为膨胀。 糊化:在温水中,当淀粉颗粒无限膨胀形成均一的粘稠液体的现象,称为淀粉的糊化。此时的温度称为糊化温度。,溶解或液化:淀粉糊化后,如果提高温度至 130℃,由于支链淀粉的全部(几乎)溶解,网状结构彻底破坏,淀粉溶液的粘度迅速下降,变为流动性较好的醪液,这种现象称为淀粉的溶解或液化。,,淀粉的变化 自糖化:在50~60℃预煮时,原料自身的淀粉酶系统活化,并分解淀粉生成糖和糊精 酸水解:在微酸条件(pH5.6~6.3),淀粉的局部酸水解现象 在70℃以下,水解的产物是糖,75~80℃产物是糊精。,(4)淀粉质原料的各个组分在水-热处理过程中的变化,糖的变化 ①己糖的变化(葡萄糖和果糖):果糖在酸性介质中不稳定,由于容易开链,所以较易分解。部分的 5-羟甲基糖醛缩合生成黄棕色色素。葡萄糖在 pH2~4 内稳定性最佳。,,② 戊糖的变化:蒸煮过程中戊糖和己糖一样脱水生产糠醛,但是后者比羟甲基糠醛稳定。,,③ 焦糖化:当温度达到糖的熔点时(185℃), 糖分脱水形成黑色无定形物,统称焦糖。焦糖不仅不能被发酵利用,而且还会阻碍糖化酶对淀粉的糖化作用,影响微生物的生长。焦糖化反应在高浓度醪液中比低浓度中较易进行。在不易与溶液接触的地方(如蒸煮锅的死角),或锅壁局部过热处都容易发生。,,④ 氨基糖反应:还原糖与氨基酸之间产生的呈色反应称为氨基糖反应。氨基糖反应不是一个简单的聚合反应,而是一个过程相当复杂的反应。NH2 己糖 糖醛 ↓ 聚合 戊糖 → 羟甲基糖醛 ─→──→ 氨基糖其他醛酮类 缩合中间产物,二、淀粉的液化(糊化),1,淀粉液化的方法 水解动力的不同 酸法、酶法、酸酶法、机械液化法 工艺的不同 间歇式、半连续式、连续式 设备的不同 管式、罐式、喷射式 加酶方式的不同 一次加酶、两次加酶、三次加酶 原料的精粗不同 淀粉质原料直接液化、精制淀粉液化,2,酶法液化 (1)酶解法液化、糖化淀粉常用的酶 α-淀粉酶:其作用是将淀粉迅速水解为糊精及少量麦芽糖,对淀粉的作用,可将长链从内部分裂成若干短链的糊精,所以也称内切淀粉酶。淀粉受到α-淀粉酶的作用后,遇碘呈色很快反应,如下表现:蓝→紫→红→浅红→不显色(即碘原色) 糖化酶:作用于淀粉的l,4键结合,能从葡萄糖键的非还原性末端起将葡萄糖单位一个一个的切断,因为是从链的一端逐渐地一个个地切断为葡萄糖,所以称为外切淀粉酶。,,β-淀粉酶: β-淀粉酶能水解α-1,4糖苷键,不能水解α- 1,6糖苷键,遇此键水解停止,也不能越过继续水解。水解由淀粉分子的非还原末端开始,水解相隔的α- 1,4键麦芽糖,届于β-构型。故叫β-淀粉酶,β-淀粉酶届于外切酶,水解产物只有麦芽糖。 异淀粉酶: 异淀粉酶能水解支链淀粉和糖原分子中支叉地位的α- 1,6糖苷键,使支叉结构断裂。但对于直链结构中的α- 1,6糖苷键却不能水解。,,普鲁蓝酶 能水解支叉结构和直链结构的α- 1,6糖苷键、支链淀粉、糖原和其β-极限糊精及普鲁蓝分子中的β- 1,6键。异淀粉酶或普鲁蓝酶与β-淀粉酶合并水解,能使支叉开裂,使β-淀粉酶继续水解,大大提高麦芽糖的产率。,,(2)酶法液化方法 间歇(升温)液化法 半连续(高温、喷淋)液化法 连续(喷射)液化法,升温液化法 工艺:将浓度30~40%淀粉乳调整pH到6.5,加入CaCl2 (0.01mol/L)和一定量淀粉酶(5~8u/克淀粉),剧烈搅拌,加热到85~90℃,保持30~60分钟,达到液化程度( DE 15~18 ),升温到100℃,灭酶10分钟。 此方法简便,但效果较差,能耗大,原料利用率低,过滤性能差。,高温液化法(喷淋连续进出料液化法) 工艺:将淀粉乳调整到适当pH和Ca2+浓度,加入一定量的液化酶,用泵打给喷淋头引入液化罐中(其中已有90℃热水),淀粉糊化后,立即液化,至保温罐90℃保温40分钟,达到液化的程度。 优点:设备和操作简单,效果比间歇液化好。 缺点:不安全,蒸汽耗量大,温度无法达到最佳温度,液化效果差,糖液过滤性能也差。,连续(喷射)液化法 利用喷射器将蒸汽直接喷射至淀粉薄层,以在短时间内达到要求的温度,完成糊化和液化。喷射后,进入保温罐,85~90℃保温45分钟。 优点:设备小,便于连续操作,原料利用率高,转化率高,蛋白质凝聚好。但要求一定压力的蒸汽,进出料的速度要稳定。,,喷射液化的几种流程: 一段高温喷射液化 单罐维持 连续出料 多段液化:多次加酶,多次加热,适用各种原料(特别是难液化的小麦,玉米淀粉),一段高温喷射液化工艺:控制要点: 淀粉乳浓度30%左右 pH6.0~6.5 喷射器出口温度(105±3)˚C,保温97~100 ˚C,30~60min。,单罐维持,,,,连续出料,多段液化工艺,喷射液化器的结构,,,,,液化程度的控制 I2试 测定DE值 DE值高,糊精太小,不利于糖化酶作用,影响催化效率,终点DE值低。 DE值低,液化不彻底,糖化速度慢,酶用量大,时间长,过滤性能差。 透光率和澄清度,,液化效果的标准 液化要均匀 蛋白絮凝效果好 液化彻底(60˚C时液化液要稳定,不出现老化现象,不含不溶性淀粉颗粒,液化液透明、清亮),三、淀粉的糖化,1,糖化理论 糖化:以无机酸或酶为催化剂,在一定温度下使淀粉水解,将淀粉全部或部分转化为葡萄糖等可发酵性糖的过程。 糖化剂 :糖化过程中所用的催化剂。包括无机酸和酶。 糖化的目的:将淀粉转化为可发酵性糖。,理论收率(111.11%)(C6H10O5)n+H2O nC6H12O6162 18 180 实际收率(105%~108%)淀粉转化率,,,DE值:糖化液中还原糖含量(以葡萄糖计)占干物质的百分率,用以表示淀粉糖的糖组成。还原糖用斐林法或碘量法测定,干物质用阿贝折光仪测定。,淀粉的水解反应过程 淀粉分子内α-1,4和α-1,6葡萄糖苷键的断裂,相对分子质量逐渐变小,依次变为糊精,低聚糖,麦芽糖和葡萄糖。 糊精是若干种分子大于低聚糖的碳水化合物,一般含2~10葡萄糖单位的为低聚糖。糊精具有旋光性,还原性,能溶于水,不溶于酒精。 与碘作用,聚合度不同颜色不同。,葡萄糖聚合度与碘液的呈色表,,糖化的过程检测 检验液化:是否有淀粉,用碘液,是否呈兰色; 检验糖化:是否水解完全 测定还原糖; 用无水酒精。,淀粉水解过程的反应,主反应:糖化(水解作用) 副反应: 复合反应(在酸和热作用下,部分葡萄糖经1,6键结合成龙胆二糖,异麦芽糖和其他低聚糖。) 分解反应(葡萄糖分解为羟甲基糠醛,有机酸和有色物质等非糖产物),2,淀粉糖化的方法 酸解法 酶解法,(1)酸解法(酸糖化法) 定义:以酸(无机酸或有机酸)为催化剂,在高温高压下将淀粉水解为葡萄糖的方法。 优点: 工艺简单,设备较单一 水解时间短,设备周转快 缺点: 需耐高温、高压和耐腐蚀的设备 副产物多,淀粉的转化率低 对原料要求高 废水难处理,酸解法中常用的酸 盐酸:高效,但中和后产生氯化物,增加糖液灰分,对葡萄糖的结晶,分离及收率会有影响。 硫酸:能力仅次于盐酸,用碳酸钙中和,经脱色,离子交换可除去。 草酸:能力低,用石灰中和生成草酸钙,脱色过滤易除去,非强酸,减少了复合反应。,淀粉酸解的工艺流程,工艺参数 淀粉浆的pH:1.5左右 水解压力:2.5~2.6大气压 水解时间:30min 一次中和pH:4.8~5.0 二次中和pH:6.7~7.0,,影响淀粉酸解速度因素 酸的种类与用量 水解的温度与压力 淀粉乳浓度的高低,(2)酶解法 定义:以酶为催化剂,在常温常压下将淀粉水解为葡萄糖的方法。包括液化和糖化两个过程,故又称双酶水解法。 优点: 反应条件温和 副反应少,淀粉质量高 可在较高淀粉浓度下水解,对预料要求不高 糖液的质量高、营养物质较丰富 缺点: 水解时间长,夏天糖液容易变质 设备较多,酶法糖化的工艺流程 液化→糖化→灭酶→过滤→贮糖计量→发酵 工艺要点: 糖化pH4.2-4.5 温度60C左右 糖化酶用量150U/g淀粉 糖化时间32小时,用无水酒精检验无糊精存在时,糖化结束,然后将pH调整至4.8-5.0,维持20分钟灭酶,,3,糖化方法的比较 水解时间:酸法短,酶法长 水解程度:酶法高 糖液杂质:酶法低,酸法高 综合,4,水解糖液的质量要求和控制要点 (1)水解糖液的质量要求 色泽:呈强黄色透明液 糊精反应:无 还原糖含量,18%左右 DE值:90%以上 透光率:60~80%左右(650nm) pH值:4.6~4.8 淀粉转化率:92%以上(实际产量/理论产量),,(2)水解糖液质量的控制要点 合理控制淀粉乳浓度 糖液要清 溶液中不含糊精 糖液要新鲜 糖液贮存容器一定要保持清洁,定期清理和清洗,防止酵母菌等浸入,第四节 糖蜜原料的处理,一、糖蜜的来源与特点 1,来源 甘蔗糖厂的副产物 甜菜糖厂的副产物,2,特点 糖蜜中干物质的浓度很大,约在80-90 Bx, 含糖分50%以上; 含5%-12%的胶体物质; 含灰分l0%-l 2%。 糖蜜中一般含有大量杂菌,主要为产酸细菌; 重金属离子, 主要是钙,铅等离子,对微生物会有抑制; 糖蜜中除了糖之外,还含有含N化合物,氨基酸,维生素。,二、糖蜜前处理的方法,1,加酸通风沉淀法 2,加热加酸沉淀法 3,添加絮凝剂澄清处理法,第五节 前体物质、抑制剂和促进剂,发酵培养基中某些成分的加入不促进微生物的生长,只是有助于调节产物的形成,这些添加的物质包括前体,抑制剂和促进剂。,,一、生物合成的前体物质 指某些化合物加入到发酵培养基中,能被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去,其自身结构并无多大变化,但产量却因前体的加入有较大提高。,,,,二、抑制剂 加入后会抑制某些代谢途径的进行,使另一途径活跃,从而获得人们所需要的某种代谢产物,或使正常代谢的某一代谢中间物积累。 最初应用于甘油发酵,抗生素工业应用最多。,,,,三、促进剂 指那些既不是营养物,又不是前体,但能提高产量的添加剂,如酶生产中的诱导物或表面活性剂等。 诱导剂能增加细胞的产酶速度,提高产酶量,但不能从根本上改变细胞原有的蛋白质模板,包括酶的底物,底物类似物,及被转化为诱导物的前替物质。,,表面活性剂(洗涤剂,吐温等):可以增加酶的产量,机理不十分清楚,一般认为是因为:改变了细胞膜的通透性同时增强了氧的传递速度,改变了菌体对氧的有效利用。,本章要求,发酵原料选择的原则 发酵工业常用主要原料及其化学组成 发酵培养基的组成 淀粉水解的理论 淀粉水解的方面(重点酶法水解) 糖蜜处理的主要方法 培养基中的前提、促进剂、抑制剂,
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